S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Introducere
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, agentul cauzal al bolii târzii, cea mai importantă boală economică a cartofilor și a roșiilor, a atras atenția cercetătorilor din diferite țări de mai bine de un secol și jumătate. Apărând brusc în Europa la mijlocul secolului al XIX-lea, a provocat o epidemie de cartofi care a rămas în memoria multor generații.
Până acum, este adesea numită „ciuperca foamei irlandeze”. Aproape o sută de ani după primele epidemii, au fost descoperite specii de cartofi sălbatici mexicani rezistenți la boala târzie, au fost dezvoltate metode de încrucișare cu cartofi cultivați (Muller, 1935) și au fost obținute primele soiuri rezistente la boala târzie (Pushkarev, 1937) . Cu toate acestea, la scurt timp după începerea cultivării lor comerciale, s-au acumulat rase ale agentului patogen târziu care au fost virulente față de soiurile rezistente. iar introducerea de noi gene de rezistență din cartofii sălbatici mexicani în soiuri a început să piardă rapid eficacitatea.
Eșecurile utilizării rezistenței monogene (verticale) au forțat crescătorii să caute modalități mai complexe de exploatare a rezistenței poligenice (orizontale) nespecifice. În ultimii ani, rase extrem de agresive au început să se acumuleze în populațiile individuale ale parazitului, provocând eroziunea chiar și a rezistenței nespecifice. Apariția tulpinilor rezistente la fungicide a cauzat probleme în utilizarea substanțelor chimice de protecție a cartofului.
Datorită diferențelor semnificative dintre oomicete și ciuperci în compoziția chimică, ultrastructură și metabolism, fungicidele, în special cele sistemice, utilizate pentru a proteja plantele de multe boli fungice, sunt ineficiente împotriva oomicetelor.
Prin urmare, în protecția chimică împotriva bolii târzii, a fost utilizată pulverizarea multiplă (de până la 12 ori pe sezon sau mai mult) cu preparate de contact cu un spectru larg de acțiune. Un pas revoluționar a fost utilizarea fenilamidelor, care sunt toxice pentru oomicete și se răspândesc sistemic în plante. Cu toate acestea, utilizarea lor pe scară largă a dus rapid la acumularea de tulpini rezistente la populațiile fungice (Davidse și colab., 1981), ceea ce a complicat semnificativ protecția plantelor. P. infestans este practic singurul parazit al zonei temperate, răul din care în agricultura ecologică nu poate fi neutralizat fără utilizarea mijloacelor chimice de protecție (Van Bruggen, 1995).
Cele de mai sus explică atenția enormă acordată de cercetători din diferite țări studiului populațiilor de P. infestans, dinamica abundenței și compoziției lor genetice, precum și mecanismele genetice de variabilitate.
Ciclul de viață al R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans dezvoltă un miceliu intercelular cu haustorie în frunzele de cartof. Hrănindu-se cu țesuturile frunzelor, provoacă formarea unor pete întunecate, care se înnegresc și putrezesc pe timp umed. Cu o înfrângere puternică, întreaga frunză moare. După o perioadă de hrănire, se formează excrescențe pe miceliu - sporangiofori - care cresc în afară prin stomate. Pe vreme umedă, formează o floare albă în jurul petelor de pe partea inferioară a frunzelor. La capetele sporangioforilor, se formează zoosporangii în formă de lămâie, care se rup și sunt transportate prin pulverizare de ploaie (Fig. 1). Căzând în picături de apă pe suprafața unei frunze de cartof, sporangii germinează cu 6-8 zoospori, care, după o perioadă de mișcare, sunt rotunjite, acoperite cu o coajă și germinează cu un tub germinal. Varza pătrunde prin stomate în țesutul frunzelor. În anumite condiții, sporangia poate crește într-un tub de creștere direct în țesutul frunzelor. În condiții favorabile, timpul de la infecție la formarea de noi sporulații este de numai 3-4 zile.
Odată pe pământ și filtrate prin sol, sporangii sunt capabili să infecteze tuberculii. Tuberculii grav afectați putrezesc în timpul depozitării; la cei slab afectați, infecția poate persista până în sezonul următor. În plus, agentul cauzal al răului târziu poate persista iarna sub formă de oospori (spori sexuali în repaus cu pereți groși) în sol pe resturile vegetale și pe semințele de roșii. Oosporii se formează pe organele vii ale plantelor atunci când tulpinile de diferite tipuri de împerechere se întâlnesc cu umiditate excesivă. Primăvara, sporularea asexuală se formează pe tuberculii infectați plantați și pe resturile de plante cu oospori; zoosporii pătrund în sol și provoacă infecția frunzelor inferioare ale plantelor. În unele cazuri, miceliul poate crește din tuberculul infectat de-a lungul părții verzi a plantei și apare de obicei în partea superioară a tulpinii.
O diferență semnificativă între oomicete și majoritatea ciupercilor constă în predominanța diplofazei în ciclul lor de viață cu meioză gametică și germinarea zigotilor (oospori) fără fisiune nucleară reductivă. Această caracteristică, plus heterotalismul dipolar care înlocuiește bisexualitatea, ar părea să facă posibilă aplicarea la omicete a abordărilor dezvoltate pentru studierea populațiilor de eucariote superioare (analiza panmixiei și subdiviziunea populațiilor, fluxurile genetice intra și interpopulare etc.). Cu toate acestea, trei factori nu permit transferul complet al acestor abordări atunci când se studiază populațiile de P. infestans.
1. Împreună cu oosporii hibrizi, în populații se formează oospori autofertili și partenogenetici (Fife și Shaw, 1992; Anikina și colab., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003) și frecvența formării lor poate fi suficient pentru a influența rezultatele testului.
2. Procesul sexual în P. infestans aduce o contribuție nesemnificativă la dinamica dimensiunii populației, deoarece ciuperca se reproduce în principal prin spori vegetativi, formând pentru mai mult de 90% din rezultatele analizei tipului de împerechere prin metoda tradițională. pe un mediu nutritiv ... sezonul de creștere este de câteva generații de sporulație asexuată (dezvoltarea bolii policiclice). Oosporii joacă un rol important în conservarea organismului în perioada în care nu există plante verzi (iarna) și în infecția primară a puieților. Apoi, în timpul verii, apare reproducerea clonală și o creștere sau, dimpotrivă, o scădere a numărului de clone individuale care apar ca urmare a recombinării sexuale, care este determinată în principal de selecția celor mai adaptate. Prin urmare, raportul clonelor individuale într-o populație la începutul și sfârșitul epifitotice poate fi complet diferit.
3. Ciclul descris este caracteristic populațiilor native de P. infestans din patria lor, America Centrală. În alte zone ale lumii, de mai bine de 100 de ani, procesul sexual nu a fost cunoscut; miceliul vegetativ din tuberculii de cartof infectați a fost etapa de iarnă. Ciclul de viață a fost complet agamic, iar răspândirea a fost de natură focală: infecția de la tuberculi plantați infectați singuri a trecut la frunze, formând focare primare ale bolii, care ar putea fuziona cu dezvoltarea masivă a bolii.
Astfel, în unele regiuni poate exista o alternanță a ciclurilor sexuale și asexuale, în timp ce în altele - doar ciclul asexual.
Originea P. INFESTANS
P. infestans a apărut în Europa la sfârșitul primei jumătăți a secolului al XIX-lea. Întrucât cartoful este originar din nord-estul Americii de Sud, s-a presupus că parazitul a fost adus de acolo în Europa în perioada de boom a salpetrului chilian. Cu toate acestea, studiile efectuate la stația de cartofi Rockefeller Center din Valea Toluca, Mexic au forțat revizuirea acestei opinii (Niederhauser 1991, 1993).
1. În Valea Toluca, speciile locale de cartof tuberos (Solanum demissum, S. bulbocastanum etc.) au diferite seturi de gene pentru rezistență verticală combinate cu un nivel ridicat de rezistență nespecifică, ceea ce indică o lungă co-evoluție cu parazitul. Speciile sud-americane, inclusiv cartofii recoltați, nu au gene de rezistență.
2. În Valea Toluca, există izolate cu tipuri de împerechere A1 și A2, în urma cărora populația încrucișată de P. infestans este răspândită; în timp ce în patria cultivată a cartofului, America de Sud, parazitul se răspândește clonal.
3. În Valea Toluca, se produc anual epidemii severe de boală târzie. Prin urmare, în rândul cercetătorilor nord-americani (Universitatea Cornell), opinia despre Mesoamerica (America Centrală) ca locul de naștere al phytophthora de cartofi este stabilită (Goodwin și colab., 1994).
Cercetătorii sud-americani nu împărtășesc această opinie. Ei cred că cartoful cultivat și parazitul său P. infestans au o patrie comună - Anzii sud-americani. Ei și-au susținut punctul de vedere prin studii moleculare privind analiza polimorfismelor ADN ale genomului mitocondrial (ADNmt) și ale genelor nucleare RAS și β-tubulină (Gomez-Alpizar și colab., 2007). Au arătat că tulpinile colectate din diferite părți ale lumii provin din trei linii ancestrale divergente care (toate trei) se găsesc în Anzii sud-americani. Haplotipurile andine sunt descendenți din două linii: izolatele din cea mai veche descendență ADNmt se găsesc pe Solanaceae în creștere sălbatică din secțiunea Anarrhicomenum din Ecuador, în timp ce izolatele din a doua linie sunt frecvente pe cartofi, roșii și nopți sălbatice. În Toluca, chiar și haplotipurile rare provin dintr-o singură descendență, variabilitatea genetică a tulpinilor din Toluca (frecvența alelică scăzută a unor site-uri variabile) sugerează un puternic efect fondator datorită derivei recente.
În plus, o nouă specie P. andina a fost găsită în Anzi, morfologic și genetic similar cu P. infestans, care, conform autorilor, indică Anzii ca un punct fierbinte de speciație în genul Phytophthora. În cele din urmă, în Europa și Statele Unite, populațiile de P. infestans includ ambele descendențe andine, în timp ce în Toluca doar una.
Această publicație a determinat răspunsul unui grup de cercetători din diferite țări, care au făcut o mulțime de lucrări experimentale pentru a revizui studiul anterior (Goss și colab., 2014). În această lucrare, în primul rând, au fost utilizate secvențe de ADN microsatelite mai informative pentru a studia polimorfismele ADN; în al doilea rând, pentru analiza grupării, a căilor de migrație, a timpului de divergență a populațiilor etc. s-au folosit modele mai avansate (statistici F, aproximări bayesiene etc.) și, în al treilea rând, a fost utilizată o comparație nu numai cu specia andină P. andina, în care s-a stabilit o natură hibridă (P. infestans x Phytophthora sp.) dar și cu speciile endemice mexicane P. mirabilis, P. Ipomoeae și Phytophthora phaseoli, care sunt P. infestans apropiate genetic incluse în aceeași cladă (Kroon și colab., 2012). Ca rezultat al acestor analize, s-a arătat fără ambiguitate că partea rădăcinii arborelui filogenetic al tuturor speciilor din genul Phytophthora luată în studiu, cu excepția hibridului P. andina, aparține tulpinilor mexicane, iar fluxul de migrație are direcția Mexic - Anzi, și nu invers, iar începutul său coincide cu colonizarea europeană a Lumii Noi (acum 300-600 de ani). Astfel, apariția speciei P. infestans, specializată pentru înfrângerea cartofilor, a avut loc în centrul genetic secundar al formării de nopți tuberoase, adică în America Centrală.
Genomul lui P. INFESTANS
În 2009, o echipă internațională de oameni de știință a secvențiat genomul P infestans complet (Haas și colab., 2009), a cărui dimensiune a fost de 240 MB. Aceasta este de câteva ori mai mare decât la speciile strâns înrudite P. sojae (95 Mb), care provoacă putrezirea rădăcinilor de soia și P. Ramorum (65 Mb), care afectează specii de arbori valoroase precum stejarul, fagul și altele. Datele obținute au arătat că genomul conține un număr mare de copii ale secvențelor repetate - 74%. Genomul conține 17797 gene care codifică proteinele, cea mai mare parte dintre acestea fiind gene implicate în procesele celulare, inclusiv replicarea ADN, transcrierea și traducerea proteinelor.
O comparație a genomilor genului Phytophthora a relevat o organizare neobișnuită a genomului, constând din blocuri de secvențe de gene conservate, în care densitatea genică este relativ mare și conținutul secvențelor repetate este relativ scăzut, iar regiunile individuale cu non-conservate secvențe genetice, cu o densitate genică scăzută și un conținut ridicat de regiuni repetate. Blocurile conservatoare reprezintă 70% (12440) din toate genele care codifică proteinele P. infestans. În cadrul blocurilor conservatoare, genele sunt de obicei strâns distanțate, cu o distanță medie intergenică de 604 pb. În zonele dintre blocurile conservatoare, distanța intergenică este mai mare (3700 pb) datorită creșterii densității elementelor care se repetă. Genele secretoare efector cu evoluție rapidă sunt localizate în regiunile sărace în gene.
Analiza secvenței genomului P. Infestans a arătat că aproximativ o treime din genom aparține unor elemente transpozabile. Genomul P. infestans conține semnificativ mai multe familii diferite de transpozoni decât alți genomi cunoscuți. Majoritatea transpozonilor P. infestans aparțin familiei țiganilor.
În genomul P. infestans, au fost identificate un număr mare de familii de gene specifice implicate în patogenie. O parte semnificativă a acestora codifică proteine efectoare care schimbă fiziologia plantei gazdă și contribuie la infecția acesteia. Acestea aparțin a două mari categorii: efectori apoplastici, care acționează în spațiile intercelulare (apoplasti), și efectori citoplasmatici, care pătrund în celule prin haustorie. Efectorii apoplastici includ enzime hidrolitice secretate, cum ar fi proteazele, lipazele și glicozilazele care distrug celulele plantei; inhibitori ai enzimelor de apărare a plantelor gazdă și toxine necrozante, cum ar fi proteinele asemănătoare Nep1 (NPL) și proteinele mici bogate în cisteină (SCR), asemănătoare Pcf.
Genele efectoare ale P. infestans sunt numeroase și de obicei mai mari decât genele nepatogene. Cele mai renumite sunt efectorii citoplasmatici RXLR și Crinkler (CNR). Efectorii citoplasmatici tipici ai oomicetelor sunt proteinele RXLR. Toate genele efectoare RXLR descoperite până acum conțin grupa amino-terminală Arg-XLeu-Arg, unde X este un aminoacid. Ca rezultat al studiului, s-a sugerat că există 563 de gene RXLR în genomul P. infestans, care este cu 60% mai mult decât în P. sojae și P. ramorum. Aproximativ jumătate din genele RXLR din genomul P. infestans sunt specifice speciilor. Efectorii RXLR au o mare varietate de secvențe. Dintre acestea, au fost identificate una mare și 150 de familii mici. Spre deosebire de proteomul principal, genele efectoare RXLR sunt de obicei localizate în regiuni sărace în gene și bogate în repetări ale genomului. Elementele mobile care determină dinamismul acestor regiuni facilitează recombinarea în aceste gene.
Efectorii citoplasmatici CRN au fost identificați inițial în transcrierile P. infestans care codificau peptidele de necroză a țesutului plantelor. De la descoperirea lor, s-au știut puține lucruri despre familia acestor efectori. Analiza genomului P. Infestans a relevat o imensă familie de 196 de gene CRN, care este mult mai mare decât cea a P. sojae (100 CRN) și P. ramorum (19 CRN). La fel ca RXLR-urile, CRN-urile sunt proteine modulare și constau dintr-un domeniu LFLAK N-terminal extrem de conservat (50 aminoacizi) și un domeniu DWL adiacent conținând diferite gene. Majoritatea CRN (60%) posedă un peptid semnal.
A fost studiată posibilitatea diferitelor CRN de a perturba procesele celulare ale plantei gazdă. În analiza necrozei plantelor, îndepărtarea proteinelor CRN2 a făcut posibilă identificarea regiunii C-terminale formate din 234 de aminoacizi (pozițiile 173-407, domeniul DXG) și provocarea morții celulare. Analiza genelor CRN de P. infestans a relevat patru regiuni C-terminale diferite, care provoacă, de asemenea, moartea celulelor în cadrul plantei. Acestea includ domeniile DC recent identificate (P. Infestans are 18 gene și 49 de pseudogene), precum și domeniile D2 (14 și 43) și DBF (2 și 1) care sunt similare cu protein kinaze. Proteinele domeniilor CRN exprimate într-o plantă sunt conservate (în absența peptidelor semnal) într-o celulă vegetală și stimulează moartea celulelor printr-un mecanism intracelular. Alte 255 secvențe care conțin domenii CRN cel mai probabil nu funcționează ca gene.
Creșterea numărului și mărimii familiilor de gene efectoare RXLR și CRN s-a datorat probabil recombinării omoloage non-alelice și duplicării genelor. În ciuda faptului că genomul conține un număr mare de elemente mobile active, nu există încă nicio dovadă directă a transferului de gene efectoare.
Metode utilizate în studiul structurii populației
Studiul structurii genetice a populațiilor se bazează în prezent pe analiza culturilor pure ale tulpinilor sale constitutive. Analiza populațiilor fără izolarea culturilor pure se efectuează și în scopuri specifice, cum ar fi, de exemplu, studierea agresivității unei populații sau prezența tulpinilor rezistente la fungicide în ea (Filippov și colab., 2004; Derevyagina și colab. , 1999). Acest tip de cercetare implică utilizarea unor metode speciale, a căror descriere depășește scopul acestei revizuiri. Pentru analiza comparativă a tulpinilor, se utilizează o serie de metode, bazate atât pe analiza structurii ADN, cât și pe studiul manifestărilor fenotipice. Analiza comparativă a populațiilor trebuie să se ocupe de un număr mare de izolate, ceea ce impune anumite cerințe metodelor utilizate. În mod ideal, acestea ar trebui să îndeplinească următoarele cerințe (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- să fie ieftin, ușor de implementat, să nu necesite costuri de timp semnificative, să se bazeze pe tehnologii disponibile în general (de exemplu, PCR);
- trebuie să genereze un număr suficient de mare de caracteristici de marker codominant independente;
- au o reproductibilitate mare;
- utilizați cantitatea minimă de țesut care urmează să fie examinat;
- să fie specific substratului (contaminarea prezentă în cultură nu trebuie să afecteze rezultatele);
- nu necesită utilizarea unor proceduri periculoase și substanțe chimice foarte toxice.
Din păcate, nu există metode care să corespundă tuturor parametrilor de mai sus. Pentru un studiu comparativ al tulpinilor din timpul nostru, se utilizează metode bazate pe analiza trăsăturilor fenotipice: virulența la soiurile de cartofi și roșii (rase de cartofi și roșii), tipul de împerechere, spectrele izoenzimelor peptidazei și glucoză-6-fosfat izomerază și privind analiza structurii ADN: fragment de restricție de lungime a polimorfismului (RFLP), care este de obicei suplimentat cu o sondă de hibridizare RG 57, analiza repetărilor microsatelite (SSR și InterSSR), amplificarea cu primeri aleatori (RAPD), amplificarea fragmentelor de restricție (AFLP) , amplificare cu primeri omologi cu secvențele elementelor mobile (de exemplu, Inter SINE PCR), determinarea haplotipurilor de ADN mitocondrial.
Scurte descrieri ale metodelor pentru studiul comparativ al tulpinilor utilizate în lucrul cu P. Infestans
Trăsături de marker fenotipic
Curse de „cartofi”
Rasele „cartofi” sunt un marker frecvent cercetat și folosit. Rasele „simple de cartofi” au o genă pentru virulența cartofilor, cele „complexe” - cel puțin două. Black și colab. (1953), rezumând toate datele disponibile, au descoperit că rasa phytophthora este capabilă să infecteze plantele cu gena / genele de rezistență corespunzătoare genei / genelor de virulență P. infestans și a găsit rasele 1, 2, 3 și 4 care infectează plantele cu genele R1, R2, R3 și respectiv R4, adică interacțiunea dintre parazit și gazdă are loc în conformitate cu principiul genei pentru genă. Mai mult, Black, cu participarea lui Gallegly și Malcolmson, a descoperit genele de rezistență R5, R6, R7, R8, R9, R10 și R11, precum și rasele corespunzătoare (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black , 1966; Malcolmson, 1970).
Există un corp extins de date privind compoziția rasială a agentului patogen din diferite regiuni. Fără a analiza aceste date în detaliu, vom indica doar o tendință generală: în cazul în care au fost utilizate soiuri cu gene de rezistență noi sau combinații ale acestora, la început a existat o oarecare slăbire a răului târziu, dar apoi au apărut și au fost selectate curse cu genele de virulență corespunzătoare s-au reluat focarele de boală târzie. Virulența specifică împotriva primelor 4 gene de rezistență (R1-R4) a fost rar observată în colecțiile colectate înainte de introducerea în cultivarea soiurilor cu aceste gene, dar numărul tulpinilor virulente a crescut brusc atunci când agentul patogen a parazitat pe soiurile care au aceste gene. Genele 5-11, pe de altă parte, erau destul de frecvente în colecții (Shaw, 1991).
Un studiu al raportului diferitelor rase în timpul sezonului de creștere, efectuat la sfârșitul anilor 1980, a arătat că la începutul dezvoltării bolii, clone cu agresivitate scăzută și 1-2 gene de virulență predomină în populație.
Mai mult, odată cu dezvoltarea bolii târzii, concentrația clonelor originale scade și numărul de rase „complexe” cu o agresivitate ridicată crește. Apariția acestuia din urmă până la sfârșitul sezonului ajunge la 100%. La depozitarea tuberculilor, există o scădere a agresivității și pierderea genelor de virulență individuale. Dinamica înlocuirii clonelor poate apărea în diferite soiuri în moduri diferite (Rybakova și Dyakov, 1990). Cu toate acestea, studiile noastre din 2000-2010 au arătat că rasele complexe se găsesc încă de la începutul epifitoticelor printre tulpini izolate atât din cartofi, cât și din roșii. Acest lucru se datorează probabil unei schimbări a populației de P. Infestans din Rusia.
În 1988-1995, frecvența apariției „superracelor” cu toate sau aproape toate genele de virulență în diferite regiuni a ajuns la 70-100%. O astfel de situație a fost observată, de exemplu, în Belarus, în regiunile Leningrad, Moscova, în Osetia de Nord și în Germania (Ivanyuk și colab., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin și colab., 1995).
Curse de "tomate"
În soiurile de roșii, au fost găsite doar 2 gene de rezistență la boala târzie - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) și Ph2 (Al-Kherb, 1988). Ca și în cazul raselor de cartofi, interacțiunea dintre roșii și P. infestans are loc pe bază de genă. Rasa T0 infectează soiurile care nu au gene de rezistență (majoritatea soiurilor utilizate industrial), rasa T1 infectează soiurile cu gena Ph1 (Ottawa), iar rasa T2 infectează soiurile cu gena Ph2.
În Rusia, aproape exclusiv T0 a fost găsit pe cartofi; T0 a predominat pe roșii la începutul sezonului, dar ulterior a fost înlocuit de cursa T1 (Dyakov și colab., 1975, 1994). După 2000, T1 pe cartofi în multe populații a început să apară chiar la începutul perioadei epifitotice. În Statele Unite, tulpinile de cartof au fost nepatogene pentru tomate, precum și rasele T0, T1 și T2, în timp ce T1 și T2 au predominat pe roșii (Vartanian și Endo, 1985; Goodwin și colab., 1995).
Tipul de împerechere
Pentru efectuarea studiului, sunt necesare tulpini de testare (de referință) cu tipuri cunoscute de împerechere - A1 și A2. Izolatul testat este inoculat cu ele în perechi în cutii Petri cu mediu de agar de ovăz. După incubare timp de 10 zile, plăcile sunt examinate pentru prezența sau absența oosporilor în mediu în zona de contact a tulpinilor. Există 4 opțiuni: tulpina aparține tipului de împerechere A1, dacă formează oospori cu testerul A2, la A2, dacă formează oospori cu testerul A1, la A1A2, dacă formează oospori cu ambii testeri sau este sterilă ( 00), dacă nu formează oospori fără tester (ultimele două grupuri sunt rare).
Pentru a determina mai rapid tipurile de împerechere, s-au făcut încercări de identificare a regiunilor genomului asociate cu tipul de împerechere, cu scopul de a le utiliza în continuare pentru a determina tipul de împerechere prin PCR. Unul dintre primele experimente de succes pentru identificarea unui astfel de site a fost realizat de cercetători americani (Judelson și colab., 1995). Folosind metoda RAPD, au reușit să identifice regiunea W16 asociată cu tipul de împerechere în descendenții celor două izolate încrucișate și să proiecteze o pereche de grunduri de 24 bp pentru a o amplifica (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') și W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') După restricționarea produsului PCR cu enzima de restricție HaeIII, a fost posibilă separarea izolatelor cu tipuri de împerechere A1 și A2.
O altă încercare de a obține markeri PCR pentru a determina tipurile de împerechere a fost întreprinsă de cercetătorii coreeni (Kim, Lee, 2002). Au identificat produse specifice folosind metoda AFLP. Ca rezultat, s-au dezvoltat o pereche de primeri PHYB-1 (înainte) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') și PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), permițând amplificarea selectivă a regiunii genomului asociată cu A2 tip de împerechere. Ulterior, au continuat această lucrare și au proiectat primerii 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, înainte) și 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), permițând amplificarea selectivă a regiunii Mat-A1, caracteristică tulpinilor cu împerechere tip A1. Utilizarea diagnosticului PCR al tipurilor de împerechere a arătat rezultate bune la studierea populațiilor de P. infestans din Republica Cehă (Mazakova și colab., 2006), Tunisia (Jmour, Hamada, 2006) și alte regiuni. În laboratorul nostru (Mytsa, Elansky, nepublicat), au fost analizate 34 de tulpini de P. infestans izolate din organele bolnave de cartofi și roșii din diferite regiuni ale Rusiei (Kostroma, Ryazan, Astrahan și regiunile Moscovei). Rezultatele analizei PCR folosind primerii specifici mai mult de 90% au coincis cu rezultatele analizei tipului de împerechere prin metoda tradițională pe un mediu nutritiv.
Tabelul 1. Variabilitatea rezistenței în clona Sib 1 (Elansky și colab., 2001)
Locația de colectare a probelor | Numărul de izolate analizate | Numărul de tulpini sensibile (S), slab rezistente (SR) și rezistente (R), buc (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Orașul Ekaterinburg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sahalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Regiunea Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Rezistența la metalaxil ca marker al populației
La începutul anilor 1980, au fost observate focare puternice de boală târzie cauzate de tulpini de P. infestans rezistente la metalaxil în diferite regiuni. Fermele de cartofi din multe țări au suferit pierderi semnificative (Dowley și O'Sullivan, 1981; Davidse și colab., 1983; Derevyagina, 1991). De atunci, în multe țări ale lumii, a fost efectuată o monitorizare constantă a apariției tulpinilor rezistente la fenilamide în populațiile de P. infestans. În plus față de o evaluare practică a perspectivelor de utilizare a medicamentelor care conțin fenilamide, construirea unui sistem de măsuri de protecție și prezicerea epifitotiei, rezistența la aceste medicamente a devenit una dintre caracteristicile marker utilizate pe scară largă pentru analiza comparativă a populațiilor acestui agent patogen. Cu toate acestea, utilizarea rezistenței la metalaxil în studiile comparative asupra populației ar trebui efectuată luând în considerare faptul că: 1 - baza genetică a rezistenței nu a fost încă determinată cu exactitate, 2 - rezistența la metalaxil este o trăsătură dependentă selectiv care se poate schimba în funcție de utilizarea fenilamidelor, 3 - diferă gradul de sensibilitate la tulpini de metalaxil într-o linie clonală (tabelul 1).
Spectre de izozime
Markerii izozimici sunt de obicei independenți de condițiile externe, prezintă moștenire mendeliană și sunt codominanți, permițând distincția între homo- și heterozigoți. Utilizarea proteinelor ca markeri genetici face posibilă identificarea atât a unor mari reorganizări ale materialului genetic, inclusiv a mutațiilor cromozomiale și genomice, cât și a substituțiilor de aminoacizi unici.
Studiile electroforetice ale proteinelor au arătat că majoritatea enzimelor există în organisme sub forma mai multor fracții care diferă în ceea ce privește mobilitatea electroforetică. Aceste fracțiuni sunt rezultatul codificării mai multor forme de enzime prin loci diferiți (izozime sau izozime) sau prin alele diferite ale aceluiași locus (alozime sau aloenzime). Adică, izozimele sunt diferite forme ale unei enzime. Diferite forme au aceeași activitate catalitică, dar diferă ușor în substituțiile unice de aminoacizi din peptidă și în sarcină. Astfel de diferențe sunt dezvăluite în timpul electroforezei.
La studierea tulpinilor de P. infestans, spectrele izoenzimelor a două proteine, peptidaza și glucoza-6-fosfat izomeraza, sunt utilizate (această enzimă este monomorfă în populațiile ruse; prin urmare, metodele de studiu nu sunt prezentate în această lucrare). Pentru a le separa în izozime într-un câmp electric, preparatele proteice izolate din organismele studiate sunt aplicate pe o placă de gel plasată într-un câmp electric. Rata de difuzie a proteinelor individuale în gel depinde de sarcină și greutatea moleculară; prin urmare, într-un câmp electric, amestecul de proteine este separat în fracții individuale, care pot fi vizualizate folosind coloranți speciali.
Studiul izoenzimelor peptidazei se efectuează pe geluri de celuloză-acetat, amidon sau poliacrilamidă. Cea mai convenabilă este metoda bazată pe utilizarea gelurilor de acetat de celuloză fabricate de Helena Laboratories Inc. Nu necesită cantități mari de materiale de testare, permite obținerea de benzi contrastante pe gel după electroforeză pentru ambele locuri enzimatice, implementarea sa nu necesită costuri mari de timp și materiale (Fig. 2).
O mică bucată de miceliu este transferată într-un microtub de 1,5 ml, se adaugă 1-2 picături de apă distilată. După aceea, proba este omogenizată (de exemplu, cu un burghiu electric cu un accesoriu de plastic adecvat pentru un microtub) și sedimentată timp de 25 de secunde pe o centrifugă la 13000 rpm. 8 μl din fiecare microtub. supernatantul este transferat pe placa aplicatoare.
Gelul de acetat de celuloză este îndepărtat din recipientul tampon, șters între două foi de hârtie de filtru și plasat cu stratul de lucru deasupra bazei de plastic a aplicatorului. Soluția de pe placă este transferată de aplicator pe gel de 2-4 ori. Gelul este transferat într-o cameră de electroforeză,
Tabelul 2. Compoziția soluției utilizate pentru colorarea gelului de acetat de celuloză în analiza izoenzimelor peptidazei, o picătură de vopsea (albastru de bromofenol) este plasată pe marginea gelului.
TRIS HCI, 0,05M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidază, 1000 U / ml 5 picături
o-dianisidină, 4 mg / ml 8 picături
MgCl2, 20 mg / ml 2 picături
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 picături
L-aminoacid oxidază, 20 u / ml 2 picături
Electroforeza se efectuează timp de 20 de minute. la 200 V. După electroforeză, gelul este transferat pe o masă de vopsit și vopsit cu o soluție specială de vopsire (Tabelul 2). 10 ml de agar DIFCO 1,6% se topesc preliminar într-un cuptor cu microunde, răcit la 60 ° C, după care 2 ml de agar se amestecă cu un amestec de vopsea și se toarnă pe gel. Dungile apar în decurs de 15-20 de minute. Reactivul L-aminoacid oxidază este adăugat chiar înainte de a amesteca soluția cu agar topit.
La populațiile ruse, locusul Pep 1 este reprezentat de genotipurile 100/100 și 92/100. Homozigotul 92/92 este extrem de rar (aproximativ 0,1%). Locus Rehr 2 este reprezentat de trei genotipuri 100/100, 100/112 și 112/112, iar toate cele 3 variante sunt destul de comune (Elanky și Smirnov, 2003, Fig. 2).
Cercetarea genomului
Polimorfism de lungime a fragmentului de restricție cu hibridizare ulterioară (RFLP-RG 57)
ADN-ul total este tratat cu enzima de restricție Eco R1, fragmentele de ADN sunt separate prin electroforeză în gel de agaroză. ADN-ul nuclear este foarte mare și are multe secvențe repetitive, ceea ce face dificilă analiza directă a numeroaselor fragmente obținute prin acțiunea enzimelor de restricție. Prin urmare, fragmentele de ADN separate în gel sunt transferate într-o membrană specială și utilizate pentru hibridizare cu sonda RG 57, care include nucleotide marcate cu etichete radioactive sau fluorescente. Această sondă hibridizează cu secvențe genomice repetitive (Goodwin și colab., 1992; Forbes și colab., 1998). După vizualizarea rezultatelor hibridizării pe un material luminos sau radioactiv, se obține un profil de hibridizare multi-locus (amprentă digitală), reprezentat de 25-29 de fragmente (Forbes și colab., 1998). Descendenții asexuali (clonali) vor avea aceleași profiluri. Prin dispunerea benzilor pe electroforetogramă, se evaluează asemănările și diferențele organismelor comparate.
Haplotipuri de ADN mitocondrial
În majoritatea celulelor eucariote, ADNmt este prezentat sub forma unei molecule de ADN circular cu catenă dublă, care, spre deosebire de cromozomii nucleari ai celulelor eucariote, se reproduce semi-conservator și nu este asociată cu moleculele proteice.
Genomul mitocondrial al P. infestans a fost secvențiat și o serie de lucrări au fost dedicate analizei lungimilor fragmentelor de restricție (Carter și colab., 1990; Goodwin, 1991; Gavino, Fry, 2002). După ce Griffith și Shaw (1998) au dezvoltat o metodă simplă și rapidă pentru determinarea haplotipurilor ADNmt, acest marker a devenit unul dintre cele mai populare în studiile P. Infestans. Esența metodei constă în amplificarea secvențială a două fragmente de ADN mitocondrial (din comun genom) cu primeri F2-R2 și F4-R4 (Tabelul 3) și restricția lor ulterioară cu enzimele de restricție MspI (primul fragment) și EcoR1 (al doilea fragment). Metoda vă permite să identificați 1 haplotipuri: Ia, IIa, Ib, IIb. Tipul II diferă de tipul I prin prezența unui insert de 2 bp și printr-o locație diferită a siturilor de restricție în regiunile P4 și P1881 (Fig. 2).
Din 1996, printre tulpinile colectate pe teritoriul Rusiei, au fost observate doar haplotipurile Ia și IIa (Elansky și colab., 2001, 2015). Ele pot fi identificate după separarea produselor de restricție cu grund F2-R2 într-un câmp electric (Fig. 4, 5). Tipurile de ADNmt sunt utilizate în analiza comparativă a tulpinilor și a populațiilor. Într-o serie de studii, s-au folosit tipuri de ADN mitocondrial pentru a izola liniile clonale și a pașaporta izolatele P. infestans (Botez și colab., 2007; Shein și colab., 2009). Folosind metoda PCR-RFLP, s-a ajuns la concluzia că ADNmt este eterogen în aceeași tulpină P. infestans (Elansky și Milyutina, 2007). Condiții de amplificare: 1x (500 sec. 94 ° C), 40x (30 sec. 90 ° C, 30 sec. 52 ° C, 90 sec. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Amestec de reacție: (20 μl): 0,2 U Taq ADN polimerază, 1x 2,5 mM tampon MgCl2-Taq, 0,2 mM fiecare dNTP, 30 pM primer și 5 ng de ADN analizat, apă deionizată - până la 20 μl.
Restricționarea produsului PCR se efectuează timp de 4-6 ore la o temperatură de 37 ° C. Amestec de restricție (20 μl): 10x MspI (2 μl), tampon de restricție 10x (2 μl), apă deionizată (6 μl), produs PCR (10 μl).
Tabelul 3. Grunduri utilizate pentru amplificarea regiunilor polimorfe ale ADNmt
Locus | grund | Lungimea și amplasarea grundului | Lungimea produsului PCR | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Amplificare aleatorie a primerului (RAPD)
La efectuarea RAPD, se utilizează un primer (uneori mai mulți amorși simultan) cu o secvență de nucleotide arbitrară, de obicei de 10 nucleotide în lungime, cu un conținut ridicat (de la 50%) de nucleotide GC și o temperatură scăzută de recoacere (aproximativ 35 ° C) . Astfel de primeri „aterizează” pe numeroase situri complementare din genom. După amplificare, se obține un număr mare de ampliconi. Numărul acestora depinde de grundul (grundele) utilizat (i) și de condițiile de reacție (concentrația MgCl2 și temperatura de recoacere).
Vizualizarea ampliconilor se realizează prin distilare în poliacrilamidă sau gel de agaroză. La efectuarea analizei RAPD, este necesar să se monitorizeze cu atenție puritatea materialului analizat, deoarece contaminarea cu alte obiecte vii poate determina o creștere semnificativă a numărului de artefacte, care sunt destul de numeroase în analiza materialului pur (Perez și colab., 1998). Utilizarea acestei metode în studiul genomului P. infestans se reflectă în multe lucrări (Judelson, Roberts, 1999; Ghimire și colab., 2002; Carlisle și colab., 2001). Selecția condițiilor de reacție și primeri (au fost studiați 51 primeri 10-nucleotidici) sunt date în articol de Abu-El Samen și colab., (2003).
Analiza repetării microsateliților (SSR)
Repetările microsatelite (repetarea secvențelor simple, SSR) sunt secvențe scurte repetate în tandem de 1-3 (uneori până la 6) nucleotide prezente în genomul nuclear al tuturor eucariotelor. Numărul de repetări succesive poate varia de la 10 la 100. Lociurile microsatelitelor apar cu o frecvență destul de mare și sunt distribuite mai mult sau mai puțin uniform pe tot genomul (Lagercrantz și colab., 1993). Polimorfismul secvențelor de microsateliți este asociat cu diferențe în numărul de repetări ale motivului de bază. Markerii microsateliți sunt codominanți, ceea ce face posibilă utilizarea acestora pentru a analiza structura populației, a determina rudenia, rutele de migrare a genotipului etc. Printre alte avantaje ale acestor markeri, ar trebui remarcat polimorfismul lor ridicat, buna reproductibilitate, neutralitate și capacitatea de a efectua analize și evaluări automate. Analiza polimorfismului repetărilor microsateliților se efectuează prin amplificare PCR folosind primerii complementari secvențelor unice care înconjoară loci microsateliți. . Inițial, analiza a fost efectuată cu separarea produselor de reacție pe un gel de poliacrilamidă. Mai târziu, angajații Applied Biosystems au propus să utilizeze grunduri etichetate fluorescent cu detectarea produselor de reacție utilizând un detector laser automat (Diehl și colab., 1990) și apoi secvențieri automate standard ale ADN-ului (Ziegle și colab., 1992). Etichetarea primerilor cu diferiți coloranți fluorescenți face posibilă analizarea mai multor markeri simultan pe o singură bandă și, în consecință, crește semnificativ productivitatea metodei și crește precizia analizei.
Primele publicații dedicate utilizării analizei SSR pentru studiul P. infestans au apărut la începutul anilor 2000. (Knapova, Gisi, 2002). Nu toți markerii propuși de autori au prezentat un grad suficient de polimorfism, cu toate acestea, doi dintre ei (4B și G11) au fost incluși în setul de 12 markeri SSR propuși de Lees și colab. (2006) și ulterior adoptați în rețeaua de cercetare Eucablight (www.eucablight .org) ca standard pentru P. infestans. Câțiva ani mai târziu, a fost publicat un studiu privind crearea unui sistem de analiză multiplex a ADN-ului P. infestans bazat pe opt markeri SSR (Li și colab., 2010). În cele din urmă, după evaluarea tuturor markerilor propuși anterior și selectarea celor mai informativi dintre aceștia, precum și optimizarea primerilor, etichetelor fluorescente și a condițiilor de amplificare, același grup de autori a prezentat un sistem de analiză multiplex într-o etapă, incluzând 12 markeri (Tabelul 4 ; Li și colab., 2013a). Primerii utilizați în acest sistem au fost selectați și etichetați cu unul dintre cei patru markeri fluorescenți (FAM, VIC, NED, PET), astfel încât intervalele dimensiunilor de alele ale primerilor cu aceleași etichete să nu se suprapună.
Autorii au efectuat analiza pe un amplificator PTC200 (MJ Research, SUA) folosind kituri QIAGEN multiplex PCR sau kituri QIAGEN Typeit Microsatellite PCR. Volumul amestecului de reacție a fost de 12.5 μL. Condițiile de amplificare au fost următoarele: pentru QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C ( 20 min); pentru QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 sec), 58 ° C (90 sec), 72 ° C (20 sec), 60 ° C ( 30 minute).
Separarea și vizualizarea produselor PCR au fost efectuate folosind un analizor automat ADN capilar ABI3730 (Applied Biosystems).
Tabelul 4. Caracteristicile a 12 markeri SSR standard folosiți pentru genotiparea P. Infestans (Li și colab., 2013a)
Nume | Numărul de alele | Gama de dimensiuni alele (bp) | Grunduri |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
PI02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
PI04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
PI70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
PI63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGGCGAGGTTTGTAGATT |
Un exemplu de vizualizare a rezultatelor analizei este prezentat în Fig. 6. Rezultatele au fost analizate folosind software-ul GeneMapper 3.7 prin compararea datelor obținute cu datele izolatelor cunoscute. Pentru a facilita interpretarea rezultatelor analizei, este necesar să se includă 1-2 izolate de referință cu un genotip cunoscut în fiecare studiu.
Metoda de cercetare propusă a fost testată pe un număr semnificativ de probe de câmp, după care autorii au standardizat protocoalele între laboratoarele a două organizații, Institutul James Hutton (Marea Britanie) și Universitatea și cercetarea Wageningen (Olanda), care, împreună cu posibilitatea de a utiliza cardurile FTA standard pentru colectarea și expedierea simplificate a probelor de ADN de P. infestans au făcut posibilă discutarea despre posibilitatea utilizării comerciale a acestei dezvoltări. În plus, o metodă rapidă și precisă de genotipare a izolatelor de P. infestans utilizând analiza SSR multiplexă a făcut posibilă efectuarea de studii standardizate ale populațiilor acestui agent patogen la scară globală și crearea unei baze de date mondiale cu privire la boala târzie în cadrul Proiectul Eucablight (www.eucablight.org), inclusiv, inclusiv rezultatele analizei microsateliților, a făcut posibilă urmărirea apariției și răspândirii de noi genotipuri în întreaga lume.
Polimorfism de lungime a fragmentului de restricție (AFLP). AFLP (polimorfism cu lungime de fragment amplificat) este o tehnologie pentru generarea de markeri moleculari aleatori folosind primerii specifici. În AFLP, ADN-ul este tratat cu o combinație de două enzime de restricție. Adaptatorii specifici sunt legați de capetele lipicioase ale fragmentelor de restricție.
Aceste fragmente sunt apoi amplificate folosind primerii complementari cu secvența adaptorului și situsul de restricție și purtând suplimentar una sau mai multe baze aleatorii la capetele lor 3 '. Setul de fragmente obținute depinde de enzimele de restricție și de nucleotidele selectate aleatoriu la capetele 3 'ale primerilor (Vos și colab., 1995). AFLP - genotiparea este utilizată pentru a studia rapid variația genetică a diferitelor organisme.
O descriere detaliată a metodei este dată în lucrările lui Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul și colab., 1999. O mulțime de lucrări comparând rezoluția metodelor AFLP și SSR au fost efectuate de cercetătorii chinezi. Au fost studiate caracteristicile fenotipice și genotipice ale 48 de izolate de P. infestans colectate din cinci regiuni din nordul Chinei. Spectrele AFLP au dezvăluit opt genotipuri diferite de ADN, spre deosebire de genotipurile SSR, pentru care nu a fost dezvăluită nicio diversitate (Guo și colab., 2008).
Amplificare cu grunduri omoloage secvențelor elementelor mobile
Markerii derivați din secvențe de retrotranspozoni sunt foarte convenabili pentru cartografierea genetică, studiul diversității genetice și procesele evolutive (Schulman, 2006). Dacă primerii sunt realizați pentru a completa secvențele stabile ale anumitor elemente mobile, este posibil să se amplifice regiunile genomului situate între ele. În studiile privind agentul cauzal al bolii târzii, a fost utilizată cu succes metoda de amplificare a regiunilor genomului folosind un primer complementar secvenței de bază a retroinei SINE (Short Intercaled Nuclear Elements) (Lavrova și Elansky, 2003). Folosind această metodă, diferențele au fost relevate chiar și în urmașii asexuali ai unui izolat. În acest sens, s-a ajuns la concluzia că metoda inter-SINE-PCR este foarte specifică și rata de mișcare a elementelor SINE în genomul Phytophthora este mare.
În genomul P. infestans, au fost identificate 12 familii de retrotranspoziții scurte (SINE); a fost investigată distribuția speciilor de retrotranspoziții scurte; au fost identificate elemente (SINE) care se găsesc în genomul numai al P. infestans (Lavrova, 2004).
Caracteristici ale aplicării metodelor de studiu comparativ al tulpinilor în studiile populației
Atunci când planificați un studiu, este necesar să înțelegeți clar obiectivele pe care le urmărește și să utilizați metodele adecvate. Astfel, unele metode permit generarea unui număr mare de caracteristici de marker independente, dar în același timp au o reproductibilitate redusă și depind puternic de reactivii utilizați, de condițiile de reacție și de contaminarea materialului în studiu. Prin urmare, în fiecare studiu al unui grup de tulpini, este necesar să se utilizeze mai multe izolate standard (de referință), dar chiar și în acest caz, rezultatele mai multor experimente sunt foarte dificil de combinat.
Acest grup de metode include RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. După amplificare, se obține un număr mare de fragmente de ADN de diferite dimensiuni. Este recomandabil să se utilizeze astfel de tehnici atunci când este necesar să se stabilească diferențe între tulpini strâns legate (descendenți părinți, mutanți de tip sălbatic etc.) sau în cazurile în care este necesară o analiză detaliată a unei probe mici. Astfel, metoda AFLP este utilizată pe scară largă în cartarea genetică a P. infestans (van der Lee și colab., 1997) și în studiile intrapopulației (Knapova, Gisi, 2002, Cooke și colab, 2003, Flier și colab, 2003). Astfel de metode sunt impracticabile de utilizat atunci când se creează baze de date de tulpini, deoarece este practic imposibil să unificăm contabilitatea rezultatelor atunci când efectuăm analize în diferite laboratoare.
În ciuda aparentei simplități și vitezei de execuție (izolarea ADN-ului fără o purificare bună, amplificare, vizualizare a rezultatelor), acest grup de metode necesită utilizarea unei metode speciale pentru documentarea rezultatelor: distilarea în gel de poliacrilamidă cu primeri marcați (radioactivi sau luminescenți) și expunerea ulterioară la lumină sau material radioactiv. Imagistica convențională cu gel de agaroză de bromură de etidiu nu este, în general, potrivită pentru aceste metode, deoarece se poate contopi un număr mare de fragmente de ADN de diferite dimensiuni.
Dimpotrivă, alte metode vă permit să generați un număr mic de caracteristici cu o reproductibilitate foarte mare. Acest grup include studiul haplotipurilor ADN-ului mitocondrial (doar două haplotipuri Ia și IIa sunt observate în Rusia), tipul de împerechere (cele mai multe izolate sunt împărțite în 2 tipuri: A1 și A2, SF autofertil rar se găsește) și spectre de izozimă peptidază ( două loci Pep1 și Pep2, formate din două izozime fiecare) și glucoză-6-fosfat izomerază (în Rusia nu există variabilitate în această trăsătură, deși polimorfism semnificativ este remarcat în alte țări ale lumii). Este recomandabil să utilizați aceste caracteristici atunci când analizați colecțiile, compilarea bazelor de date regionale și globale. În cazul analizei izozimelor și haplotipurilor ADN-ului mitocondrial, este posibil să nu se facă deloc tulpini standard, în timp ce în analiza tipurilor de împerechere sunt necesare două izolate de testare cu tipuri de împerechere cunoscute.
Condițiile de reacție și reactivii pot afecta doar contrastul produsului pe electroforetogramă; manifestarea artefactelor în aceste tipuri de studii este puțin probabilă.
În prezent, majoritatea populațiilor din partea europeană a Rusiei sunt reprezentate de tulpini ale ambelor tipuri de împerechere (Tabelul 6), printre acestea există izolate cu tipurile Ia și IIa de ADN mitocondrial (alte tipuri de ADNmt găsite în lume nu au a fost găsit în Rusia după 1993). Spectrele izozimelor peptidazei sunt reprezentate de două genotipuri la locusul Pep1 (100/100, 92/92 și heterozigot 92/100, iar genotipul 92/92 este extrem de rar (<0,3%)) și două genotipuri la Pep 2 locus (100/100, 112/112 și heterozigot 100/112, cu genotipul 112/112 care apare mai rar decât 100/100, dar și destul de des).
Nu a existat nicio variabilitate în spectrul izoenzimelor izomerazei glucozei-6-fosfat după 1993 (dispariția liniei clonale US-1); toate izolatele studiate aveau genotipul 100/100 (Elansky și Smirnov, 2002).
Al treilea grup de metode permite obținerea unui grup suficient de caracteristici de marker independente, cu o reproductibilitate ridicată. Astăzi, acest grup include sonda RFLP-RG57, care produce 25-29 de fragmente de ADN de diferite dimensiuni. RFLP-RG57 poate fi utilizat atât la analiza eșantioanelor, cât și la compilarea bazelor de date. Cu toate acestea, această metodă este mult mai scumpă decât precedentele, consumă mult timp și necesită o cantitate suficient de mare de ADN foarte purificat. Prin urmare, cercetătorul este obligat să limiteze volumul materialului testat.
Dezvoltarea RFLP-RG57 la începutul anilor 90 ai secolului trecut a intensificat în mod semnificativ studiile populației asupra agentului cauzal al bolii târzii. A devenit baza metodei bazată pe selecția și analiza „liniilor clonale” (vezi mai jos). Împreună cu RFLP-RG57, tipul de împerechere, amprentarea ADN-ului (metoda RFLP-RG57), spectrele izoenzimelor peptidazei și glucozei-6-fosfat izomerazei și tipul ADN mitocondrial sunt utilizate pentru a identifica liniile clonale. Datorită lui, s-a arătat al., 1994), înlocuirea populațiilor vechi cu altele noi (Drenth și colab., 1993; Sujkowski și colab., 1994; Goodwin și colab., 1995a) și descendențe clonale care predomină în multe țări din lumea a fost identificată. Studiile asupra tulpinilor rusești folosind această metodă au arătat un polimorfism genotipic ridicat al tulpinilor părții europene și monomorfismului populațiilor din părțile asiatice și din Orientul Îndepărtat al Rusiei (Elansky și colab., 2001). Și acum această metodă rămâne principala în studiile populației cu P. infestans. Cu toate acestea, distribuția sa largă este împiedicată de costul destul de ridicat și de intensitatea forței de muncă în executare.
O altă tehnică promițătoare care este utilizată rar în studiile P. infestans este analiza repetării microsateliților (SSR). În prezent, această metodă este utilizată pe scară largă pentru a izola liniile clonale. Pentru analiza tulpinilor, astfel de trăsături de marker fenotipic precum prezența genelor de virulență la soiurile de cartofi (Avdey, 1995, Ivanyuk și colab., 2002, Ulanova și colab., 2003) și roșii au fost utilizate pe scară largă (și continuă să fie utilizate) . Până acum, genele virulenței față de soiurile de cartofi și-au pierdut valoarea ca trăsături de marker pentru studiile populației datorită apariției numărului maxim (sau apropiat) de gene de virulență în marea majoritate a izolatelor. În același timp, gena virulenței T1 pentru soiurile de roșii care poartă gena Ph1 corespunzătoare este încă folosită cu succes ca trăsătură de marker (Lavrova și colab., 2003; Ulanova și colab., 2003).
În multe studii, rezistența la fungicide este utilizată ca marker. Această trăsătură nu este de dorit să fie utilizată în studiile populației datorită apariției destul de ușoare a mutațiilor de rezistență în liniile clonale după aplicarea fungicidelor care conțin metalaxil (sau mefenoxam) în teren. De exemplu, s-au arătat diferențe semnificative în nivelul de rezistență în linia clonală Sib1 (Elansky și colab., 2001).
Astfel, tipul de împerechere, spectrul izozimului peptidazei, tipul ADN mitocondrial, RFLP-RG57, SSR sunt markeri preferați pentru crearea de bănci de date și etichetarea tulpinilor din colecții. Pentru a compara eșantioane limitate, dacă este necesar să utilizați numărul maxim de caracteristici de marker, puteți utiliza AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Tabelul 5). Cu toate acestea, trebuie amintit că aceste metode sunt slab reproductibile, iar în fiecare experiment individual (ciclu de electroforeză de amplificare) este necesar să se utilizeze mai multe izolate de referință.
Tabelul 5. Compararea diferitelor metode de cercetare a tulpinilor P. infestans
Criteriu | TC | Polițiști Isofer | ADNm | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Cantitatea de informații | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproductibilitate | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Posibilitatea artefactelor | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Costa | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intensitatea muncii | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Viteza de analiză ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Notă: H - scăzut, C - mediu, B - înalt; НС * - intensitatea muncii este scăzută atunci când se utilizează gel de agaroză sau automat
genotipor, mediu - prin distilare în gel de poliacrilamidă cu grunduri marcate,
** - fără a lua în calcul timpul petrecut pentru creșterea miceliului pentru izolarea ADN-ului.
Structura populației
Liniile clonale
În absența recombinării sau a contribuției sale nesemnificative la structura populației, populația constă într-un anumit număr de clone, schimburi genetice între care sunt extrem de rare.
La astfel de populații, este mai informativ să studiezi nu frecvențele genelor individuale, ci frecvențele genotipurilor care au o origine comună (linii clonale sau linii clonale) și diferă doar în mutațiile punctuale. Studiile populației asupra patogenului târziu și analiza liniilor clonale s-au accelerat semnificativ de la apariția metodei RFLP-RG57 la începutul anilor 90 ai secolului trecut. Împreună cu RFLP-RG57, tipul de împerechere, spectrele izoenzimelor peptidazei și glucozei-6-fosfat izomerazei și tipul ADN mitocondrial sunt utilizate pentru a identifica liniile clonale. Caracteristicile celor mai frecvente linii clonale sunt prezentate în Tabelul 6.
Clona SUA-1 a dominat populațiile de pretutindeni până la sfârșitul anilor 80, după care a început să fie înlocuită de alte clone și a dispărut din Europa și America de Nord. Se găsește acum în Extremul Orient (Filipine, Taiwan, China, Japonia, Coreea, Koh și colab., 1994, Mosa și colab., 1993), în Africa (Uganda, Kenya, Rwanda, Goodwin și colab., 1994, Vega- Sanchez și colab., 2000; Ochwo și colab., 2002) și în America de Sud (Ecuador, Brazilia, Peru, Forbes și colab., 1997; Goodwin și colab., 1994). Nu au fost identificate tulpini aparținând liniei US-1 numai în Australia. Aparent, izolatele P. infestans au venit în Australia cu un alt val de migrație (Goodwin, 1997).
Clona SUA-6 a migrat din nordul Mexicului în California la sfârșitul anilor 70 și a provocat o epidemie de cartofi și roșii după 32 de ani de boală fără boală. Datorită agresivității sale ridicate, a înlocuit clona SUA-1 și a început să domine coasta de vest a Statelor Unite (Goodwin și colab., 1995a).
Genotipurile US-7 și US-8 au fost descoperite în Statele Unite în 1992 și deja în 1994 au fost larg distribuite în Statele Unite și Canada. În timpul unui sezon de camp, clona US-8 este capabilă să deplaseze aproape complet clona US-1 în parcele de cartofi infectate inițial cu ambele clone în concentrație egală (Miller și Johnson, 2000).
Clonele BC-1 până la BC-4 au fost identificate în Columbia Britanică într-un număr mic de izolate de la Goodwin și colab., 1995b). Clona SUA-11 s-a răspândit pe scară largă în Statele Unite și a înlocuit SUA-1 în Taiwan. Clonele JP-1 și EC-1, împreună cu clona US-1, sunt comune în Japonia și, respectiv, în Ecuador (Koh și colab., 1994; Forbes și colab., 1997).
SIB-1 este o clonă care a predominat în Rusia asupra unui teritoriu vast, din regiunea Moscovei până la Sahalin. În regiunea Moscovei, a fost descoperit în 1993, iar unele populații de câmp erau formate în principal din tulpini ale acestei linii clonale, foarte rezistente la metalaxil. După 1993, prevalența acestei clone a scăzut semnificativ. În afara Uralilor în 1997-1998, SIB-1 a fost găsit peste tot, cu excepția Teritoriului Khabarovsk (clona SIB-2 este răspândită acolo). Separarea spațială a clonelor cu diferite tipuri de împerechere exclude procesul sexual din Siberia și Orientul Îndepărtat. În regiunea Moscovei, spre deosebire de Siberia, populația este reprezentată de multe clone; aproape fiecare izolat are un genotip multilocus unic (Elansky și colab., 2001, 2015). Această diversitate nu poate fi explicată doar prin importul de tulpini fungice din diferite părți ale lumii cu material semințelor importate. Deoarece ambele tipuri de împerechere apar în populație, este posibil ca diversitatea sa să fie, de asemenea, recombinată. Astfel, în Columbia Britanică, apariția genotipurilor BC-2, BC-3 și BC-4 este presupusă datorită hibridizării clonelor BC-1 și US-6 (Goodwin și colab., 1995b). Este posibil ca tulpinile hibride să fie găsite în populațiile din Moscova. De exemplu, tulpinile MO-4, MO-8 și MO-11 heterozigoți pentru locusul PEP pot fi hibrizi între tulpinile MO-12, MO-21, MO-22, având tipul de împerechere A2 și homozigoți pentru o alelă a PEP locus și tulpina MO-8, având tipul de împerechere A1 și homozigot pentru o altă alelă a locusului. Și dacă este așa, iar în populațiile moderne de P. infestans există o tendință către o creștere a rolului procesului sexual, atunci valoarea informațională a analizei clonelor multilocus va scădea (Elansky și colab., 2001, 2015 ).
Variația în linii clonale
Până în anii 90 ai secolului al XX-lea, linia clonală US-20 a fost răspândită în lume. Majoritatea populațiilor de pe câmp și regionale au constat exclusiv din tulpini cu genotipul SUA-1. Cu toate acestea, au fost observate și diferențe între izolate, cel mai probabil cauzate de un proces mutațional. Mutațiile au apărut atât în ADN-ul nuclear, cât și în cel mitocondrial și au afectat, printre altele, nivelul de rezistență la medicamentele fenilamidice și numărul de gene de virulență. Liniile care diferă de genotipurile originale prin mutații sunt indicate prin numere suplimentare după punctul care urmează denumirii genotipului original (de exemplu, linia mutantă US-1 a liniei clonale US-1.1). Liniile ADN de amprentă digitală US-1 și US-1.5 conțin linii accesorii de diferite dimensiuni (Goodwin și colab., 1.6a, 1995b); linia clonală US-1995 diferă, de asemenea, de SUA-6.3 într-o linie accesorie (Goodwin, 6, Tabelul 1997).
În studiul ADN-ului mitocondrial, s-a constatat că numai ADN-ul mitocondrial de tip 1b se găsește în linia clonală US-1 (Carter și colab., 1990). Cu toate acestea, în studiul tulpinilor acestei linii clonale din Peru și Filipine, s-au găsit izolate ale căror tipuri de ADN mitocondrial difereau de 1b în prezența inserțiilor și delețiilor (Goodwin, 1991, Koh și colab., 1994).
Tabelul 6. Genotipuri multilocus ale unor linii clonale ale P. infestans
Nume | Tipul de împerechere | Izozime | Amprente ADN | Tip MtDNA | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
CE-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Notă: * - fără date.
Tabelul 7. Genotipuri multilocus și liniile lor mutante
Nume | Tipul de împerechere | | Amprente ADN (RG57) | Notițe | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Genotip original 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutație în PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutație în RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutație în RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutație în RG57 și PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutație în RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Genotip original 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutație în PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutație în RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutație în RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutație în RG57 și PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutație în RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Genotip original 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutație în RG57 |
Există, de asemenea, modificări în spectrul izozimelor. De regulă, acestea sunt cauzate de descompunerea unui organism inițial heterozigot pentru această enzimă în omozigote. În 1993, pe fructele de roșii, am identificat o tulpină cu caracteristici caracteristice US-1: amprentă RG57, tip ADN mitocondrial și genotip 86/100 pentru glucoză-6-fosfat-izomerază, dar a fost homozigotă (100/100) pentru primul locus al peptidazei în locul unui heterozigot 92/100 tipic acestei linii clonale. Am denumit genotipul acestei tulpini MO-17 (Tabelul 6). Liniile mutante US-1.1 și US-1.4 diferă, de asemenea, de US-1 prin mutații la primul locus peptidază (Tabelul 7).
Mutațiile care duc la modificări ale numărului de gene de virulență pentru soiurile de cartofi și roșii sunt destul de frecvente. Au fost remarcate printre izolatele liniei clonale US-1 la populațiile din Olanda (Drenth și colab., 1994), Peru (Goodwin și colab., 1995a), Polonia (Sujkowski și colab., 1991), nordul Americii de Nord ( Goodwin și colab.,., 1995b). Diferențele în numărul de gene ale virulenței cartofului au fost, de asemenea, observate printre izolatele din liniile clonale US-7 și US-8 din Canada și Statele Unite (Goodwin și colab., 1995a), printre izolatele din linia SIB-1 din Asia parte a Rusiei (Elansky și colab., 2001).
Izolatele cu diferențe puternice în nivelurile de rezistență la medicamentele fenilamidice au fost identificate în populațiile de câmp monoclonal, toate aparținând liniei clonale Sib-1 (Elansky și colab., 2001, Tabelul 1). Aproape toate tulpinile liniei clonale US-1 sunt extrem de sensibile la metalaxil; cu toate acestea, izolatele foarte rezistente ale acestei linii au fost izolate în Filipine (Koh și colab., 1994) și în Irlanda (Goodwin și colab., 1996).
Populațiile moderne de P. infestans
America Centrală (Mexic)
Populația P. infestans din Mexic diferă semnificativ de alte populații mondiale, ceea ce se datorează în primul rând poziției sale istorice. Numeroase studii ale acestei populații și ale speciilor înrudite ale P. infestans din clada Phytophthora, precum și ale speciilor locale din genul Solanum, au condus la concluzia că evoluția agentului patogen în partea centrală a Mexicului a avut loc împreună cu evoluția plantelor gazdă și a fost asociat cu recombinarea sexuală (Grünwald, Flier, 2005). Ambele tipuri de împerechere sunt reprezentate în populație și în proporții egale, iar prezența oosporilor în sol, pe plante și tuberculi de cartofi și specii de Solanum înrudite sălbatice confirmă prezența unui proces sexual în populație (Fernández-Pavía et al., 2002). Studii recente despre Valea Toluca și împrejurimile sale (centrul prezumtiv de origine al agentului patogen) au confirmat diversitatea genetică ridicată a populației locale de P. infestans (134 genotipuri multilocus într-un eșantion de 176 probe) și prezența mai multor subpopulații diferențiate în regiune (Wang și colab., 2017). Factorii care contribuie la această diferențiere sunt împărțirea spațială a subpopulațiilor caracteristice zonelor de munte din centrul Mexicului, diferențele dintre condițiile de cultivare și soiurile de cartofi utilizate în văi și munți și prezența speciilor de Solanum sălbatice tuberoase care pot acționa ca gazde alternative (Fry et al ., 2009).
Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că populațiile de P. infestans din nordul Mexicului sunt destul de clonale și mai asemănătoare cu populațiile nord-americane, ceea ce poate indica faptul că acestea sunt noile genotipuri (Fry și colab., 2009).
America de nord
Populațiile nord-americane de P. infestans au avut întotdeauna o structură foarte simplă, iar caracterul lor clonal a fost stabilit cu mult înainte de utilizarea analizei microsatelite. Până în 1987, linia clonală US-1 a dominat în Statele Unite și Canada (Goodwin și colab., 1995). La mijlocul anilor 70, când au apărut fungicide pe bază de metalaxil, această clonă a început să fie înlocuită cu alte genotipuri mai rezistente care au migrat din Mexic (Goodwin și colab., 1998). Până la sfârșitul anilor 90. genotipul US-8 a înlocuit complet genotipul US-1 din Statele Unite și a devenit linia clonală dominantă pe cartofi (Fry și colab., 2009; Fry și colab., 2015). Situația a fost diferită cu roșiile, care conțineau în mod constant mai multe linii clonale, iar compoziția lor s-a schimbat de la an la an (Fry și colab., 2009).
În 2009, în Statele Unite a izbucnit o epidemie pe scară largă de boală târzie asupra roșiilor. O caracteristică a acestei pandemii a fost apariția aproape simultană în multe locuri din nord-estul Statelor Unite și sa dovedit a fi asociată cu vânzările masive de răsaduri infectate de roșii în centre mari de grădină (Fry și colab., 2013). Pierderile de recoltă au fost enorme. Analiza prin microsatelite a probelor afectate a relevat că tulpina pandemică aparținea liniei clonale de împerechere de tip US-22 A2. În 2009, ponderea acestui genotip în populația americană de P. infestans a ajuns la 80% (Fry și colab., 2013). În anii următori, proporția de genotipuri agresive SUA-23 (în principal pe roșii) și SUA-24 (pe cartofi) a crescut constant în populație, cu toate acestea, după 2011, rata de detectare a SUA-24 a scăzut semnificativ și până în prezent, aproximativ 90% din populația de agenți patogeni din Statele Unite este reprezentată de genotipul SUA-23 (Fry și colab., 2015).
În Canada, ca și în Statele Unite, la sfârșitul anilor '90. genotipul dominant US-1 a fost înlocuit de US-8, a cărui poziție dominantă a rămas neschimbată până în 2008. În 2009-2010. În Canada, au existat epidemii grave de boală târzie asociate cu vânzarea răsadurilor de tomate infectate, dar acestea au fost cauzate de genotipurile US-23 și US-8 (Kalischuk și colab., 2012). Diferențierea geografică clară a acestor genotipuri a fost remarcabilă: SUA-23 a dominat provinciile de vest ale Canadei (68%), în timp ce SUA-8 a dominat provinciile de est (83%). În anii următori, SUA-23 s-a răspândit în regiunile estice; totuși, în general, ponderea sa în populație a scăzut ușor pe fondul apariției genotipurilor SUA-22 și SUA-24 în țară (Peters și colab., 2014 ). Până în prezent, SUA-23 menține o poziție dominantă în toată Canada; SUA-8 este prezentă în Columbia Britanică, în timp ce SUA-23 și SUA-24 sunt prezente în Ontario (Peters, 2017).
Astfel, populațiile nord-americane de P. infestans sunt în principal linii clonale. În ultimii 40 de ani, numărul de genotipuri clonale detectate a ajuns la 24. În ciuda faptului că tulpini ale ambelor tipuri de împerechere sunt prezente în populație, probabilitatea apariției unor noi genotipuri ca urmare a recombinării sexuale rămâne destul de scăzută. Cu toate acestea, în ultimii 20 de ani, au fost înregistrate mai multe cazuri de apariție a populațiilor efemere recombinate (Gavino și colab., 2000; Danies și colab., 2014; Peters și colab., 2014) și, într-un caz, rezultatul de încrucișare a fost genotipul US-11, care a fost înrădăcinat în America de Nord timp de mulți ani (Gavino și colab., 2000). Până în 2009, schimbările în structura populațiilor erau asociate cu apariția unor genotipuri noi, mai agresive, cu migrarea lor ulterioară și deplasarea predecesorilor dominanți anterior. Ce s-a întâmplat în 2009-2010 în SUA și Canada, epifitotica a arătat pentru prima dată că în era globalizării, focarele bolii pot fi asociate cu răspândirea activă a unor noi genotipuri la vânzarea materialului săditor infectat.
America de Sud
Până de curând, studiile populațiilor sud-americane de P. infestans nu erau nici regulate, nici la scară largă. Se știe că structura acestor populații este destul de simplă și include 1-5 linii clonale per țară (Forbes și colab., 1998). Deci, până în 1998, genotipurile US-1 (Brazilia, Chile) BR-1 (Brazilia, Bolivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Columbia, Peru și Venezuela), AR-1, AR au fost găsite pe cartofi -2, AR-3, AR-4 și AR-5 (Argentina), PE-3 și PE-7 (sudul Peru). Împerecherea de tip A2 a fost prezentă în Brazilia, Bolivia și Argentina și nu a fost găsită dincolo de granița boliviană-peruviană în zona lacului Titicaca, în spatele căreia genotipul EC-1 A1 domina în Anzi. La tomate, US-1 a rămas genotipul dominant în toată America de Sud.
Situația a persistat mai mult sau mai puțin în anii 2000. Un punct important a fost descoperirea unei noi linii clonale EC-2 de tip A2 pe rudele sălbatice ale cartofilor (S. brevifolium și S. tetrapetalum) în Anzii de Nord (Oliva și colab., 2010). Studiile filogenetice au arătat că această linie nu este complet identică cu P. infestans, deși este strâns legată de aceasta, în legătură cu care s-a propus să o luăm în considerare, precum și o altă linie, EC-3, izolată de arborele de tomate S. betaceum crescând în Anzi, o nouă specie numită P. andina; cu toate acestea, statutul acestei specii (o specie independentă sau un hibrid de P. infestans cu o linie încă necunoscută) este încă neclar (Delgado et al., 2013).
În prezent, toate populațiile sud-americane de P. infestans sunt clonale. În ciuda prezenței ambelor tipuri de împerechere, nu au fost identificate populații recombinate. La tomate, genotipul US-1 este omniprezent, aparent deplasat din cartofi de către tulpini locale, a căror origine exactă este încă necunoscută. În Brazilia, Bolivia și Uruguay, genotipul BR-1 este prezent; în Peru, împreună cu US-1 și EC-1, există și alte câteva genotipuri locale. În Anzi, poziția dominantă este păstrată de linia clonală EC-1, a cărei relație cu P. andina recent descoperită rămâne necunoscută. Singurul loc „instabil” unde pentru perioada 2003-2013. au existat schimbări semnificative în populație, a devenit Chile (Acuña și colab., 2012), unde în 2004-2005. populația de agenți patogeni a devenit caracterizată de rezistența la metalaxil și un nou haplotip ADN mitocondrial (Ia în locul Ib prezent anterior). 2006 - 2011 În populație, a dominat genotipul 21 (conform SSR), ponderea acestuia a ajuns la 90%, după care palma a trecut la genotipul 20, a cărei frecvență de apariție în următorii doi ani a fost menținută la aproximativ 67% (Acuña, 2015).
Europa
În istoria Europei, au existat cel puțin două valuri de migrație a P. infestans din America de Nord: în secolul al XIX-lea. (HERB-1) și începutul secolului XX (SUA-1). Distribuția omniprezentă a fungicidelor care conțin metalaxil în anii '70. a dus la deplasarea genotipului dominant US-1 și înlocuirea acestuia cu noi genotipuri. Ca rezultat, în majoritatea țărilor din Europa de Vest, populațiile agentului patogen au fost reprezentate în principal de mai multe linii clonale.
Utilizarea analizei microsateliților pentru analiza populațiilor de agenți patogeni a făcut posibilă identificarea schimbărilor grave care au avut loc în Europa de Vest în 2005-2008. În 2005, a fost descoperită o nouă linie clonală în Marea Britanie, numită 13_A2 (sau „Blue 13”) și caracterizată prin tipul de împerechere A2, agresivitate ridicată și rezistență la fenilamide (Shaw și colab., 2007). Același genotip a fost găsit în probele colectate în 2004 în Olanda și nordul Franței, sugerând că a migrat în Marea Britanie din Europa continentală, posibil cu cartofi de sămânță (Cooke și colab., 2007). Studiul genomului reprezentanților acestei linii clonale a arătat un grad ridicat de polimorfism al secvenței sale (până în 2016, numărul variațiilor sale subclonali a ajuns la 340) și un grad semnificativ de variație a nivelului de expresie genetică, incl. gene efectoare în timpul infecției plantelor (Cooke și colab., 2012; Cooke, 2017). Aceste caracteristici, alături de durata crescută a fazei biotrofice, ar fi putut provoca agresivitatea crescută a 13_A2 și capacitatea sa de a infecta chiar și soiurile de cartofi rezistente la boala târzie.
În următorii câțiva ani, genotipul s-a răspândit rapid în țările din nord-vestul Europei (Marea Britanie, Irlanda, Franța, Belgia, Țările de Jos, Germania), cu deplasarea simultană a genotipurilor 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry și colab.) , 2010; Gisi și colab., 2011; Van den Bosch și colab., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Potrivit site-ului www.euroblight.net, ponderea 13_A2 în populațiile acestor țări a ajuns la 60-80% și mai mult; prezența acestui genotip a fost înregistrată și în unele țări din estul și sudul Europei. Cu toate acestea, în 2009-2012. 13_A2 și-a pierdut pozițiile dominante în Marea Britanie și Franța, cedând liniei 6_A1 (8_A1 în Irlanda), iar în Olanda și Belgia a fost parțial înlocuit de genotipurile 1_A1, 6_A1 și 33_A2 (Cooke și colab., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Până în prezent, aproximativ 70% din populația vest-europeană a P. infestans este monoclonală. Potrivit site-ului www.euroblight.net, genotipurile dominante din țările din Europa de Nord-Vest (Marea Britanie, Franța,
Olanda, Belgia) rămân, aproximativ în proporții egale, 13_A2 și 6_A1, iar acesta din urmă practic nu apare în afara regiunii specificate (cu excepția Irlandei), dar are deja cel puțin 58 de subclone (Cooke, 2017). Variațiile 13_A2 sunt prezente în număr vizibil în Germania și sunt observate sporadic și în țările din Europa Centrală și de Sud. Genotipul 1_A1 reprezintă o parte semnificativă a populațiilor din Belgia și parțial Olanda și Franța. Genotipul 8_A1 s-a stabilizat în populația europeană la nivelul de 3-6%, cu excepția Irlandei, unde își păstrează poziția de lider și este împărțit în două subclone (Stellingwerf, 2017). În cele din urmă, în 2016, a existat o creștere a frecvenței de apariție a noilor genotipuri 36_A2 și 37_A2, înregistrate pentru prima dată în 2013-2014; până în prezent, aceste genotipuri se găsesc în Olanda și Belgia și parțial în Franța și Germania, precum și în partea de sud a Marii Britanii (Cooke, 2017). Aproximativ 20-30% din populația vest-europeană este reprezentată de genotipuri unice în fiecare an.
Spre deosebire de Europa de Vest, până la apariția genotipului 13_A2, populațiile din Europa de Nord (Suedia, Norvegia, Danemarca, Finlanda) erau reprezentate nu de linii clonale, ci de un număr mare de genotipuri unice (Brurberg și colab.,
2011). În perioada de răspândire activă a 13_A2 în Europa de Vest, prezența acestui genotip în Scandinavia nu a fost observată până în 2011, când a fost descoperită pentru prima dată în Iutlanda de Nord (Danemarca), unde se cultivă în principal soiuri industriale de cartofi cu utilizarea activă a metalaxilului -conținând fungicide (Nielsen și colab., 2014). Potrivit www.euroblight.net, genotipul 13_A2 a fost detectat și în mai multe eșantioane din Norvegia și Danemarca în 2014 și în mai multe eșantioane norvegiene în 2016; în plus, în 2013, s-a observat prezența genotipului 6_A1 într-o cantitate mică în Finlanda. Motivul principal al eșecului 13_A2 și al altor linii clonale în cucerirea Scandinaviei este considerat a fi diferențele climatice ale acestei regiuni față de țările Europei de Vest.
Pe lângă faptul că verile răcoroase și iernile reci contribuie la supraviețuirea oosporilor mai degrabă decât a miceliului vegetativ (Sjöholm și colab., 2013), înghețarea solului în timpul iernii (care de obicei nu are loc în țările mai calde din Europa de Vest) contribuie la sincronizarea germinării și plantării oosporilor. cartof, care le sporește rolul de sursă de infecție primară (Brurberg și colab., 2011). De asemenea, trebuie remarcat faptul că, în condițiile nordice, dezvoltarea infecției din oospori depășește dezvoltarea infecției tuberoase, care previne în cele din urmă dominarea unor linii clonale chiar mai agresive, dar dezvoltate ulterior (Yuen, 2012). Structura celor mai studiate populații de P. infestans din Europa de Est (Polonia, statele baltice) este foarte similară cu cea din Scandinavia.
Ambele tipuri de împerechere sunt prezente și aici, iar marea majoritate a genotipurilor determinate de analiza SSR sunt unice (Chmielarz și colab., 2014; Runno-Paurson și colab., 2016). La fel ca în Europa de Nord, răspândirea liniilor clonale (în principal a genotipului 13_A2) practic nu a afectat populațiile locale ale agentului patogen, care păstrează un nivel ridicat de diversitate cu absența liniilor dominante pronunțate.
Prezența 13_A2 este observată ocazional în câmpurile cu soiuri comerciale de cartofi. În Rusia, situația se dezvoltă în mod similar. Analiza microsatelit a izolatelor de P. infestans colectate în 2008-2011 în 10 regiuni diferite din partea europeană a Rusiei, au prezentat un grad ridicat de diversitate genotipică și o lipsă completă de coincidențe cu liniile clonale europene (Statsyuk și colab., 2014). Câțiva ani mai târziu, un studiu al probelor de P. infestans colectate în regiunea Leningrad în 2013-2014 a arătat diferențe semnificative între acestea și genotipurile din această regiune identificate în studiul anterior. În ambele studii, genotipurile vest-europene nu au fost găsite (Beketova și colab., 2014; Kuznetsova și colab., 2016).
Diversitatea genetică ridicată a populațiilor est-europene de P. infestans și absența liniilor clonice dominante în acestea pot fi legate de mai multe motive. În primul rând, ca și în Europa de Nord, condițiile climatice ale țărilor considerate contribuie la formarea oosporilor ca sursă primară de infecție (Ulanova și colab., 2010; Chmielarz și colab., 2014). În al doilea rând, o proporție semnificativă de cartofi produși în aceste țări sunt cultivate în ferme private mici, adesea înconjurate de păduri sau alte obstacole în calea liberei circulații a materialului infecțios (Chmielarz și colab., 2014). De regulă, cartofii cultivați în astfel de condiții nu sunt practic tratați cu substanțe chimice, iar alegerea soiurilor se bazează pe rezistența lor târzie, adică nu există o presiune selectivă pentru agresivitate și rezistență la metalaxil, ceea ce privește genotipurile rezistente, cum ar fi 13_A2, de avantaje față de alte genotipuri (Chmielarz și colab., 2014). În cele din urmă, datorită dimensiunilor reduse ale terenurilor, proprietarii lor nu practică de obicei rotația culturilor, cultivând cartofi de ani de zile în același loc, ceea ce contribuie la acumularea unui inocul divers din punct de vedere genetic (Runno-Paurson și colab., 2016; Elansky , 2015; Elansky și colab., 2015).
Asia
Până de curând, structura populațiilor de P. infestans din Asia a rămas relativ slab înțeleasă. Se știa că este reprezentat în principal de linii clonale, iar efectul recombinării sexuale asupra apariției de noi genotipuri este foarte mic. Deci, de exemplu, în 1997-1998. În partea asiatică a Rusiei (Siberia și Orientul Îndepărtat), populația patogenă a fost reprezentată doar de trei genotipuri cu predominanță a genotipului SIB-1 (Elansky și colab., 2001). Prezența liniilor de agenți patogeni clonali a fost demonstrată în țări precum China, Japonia, Coreea, Filipine și Taiwan (Koh și colab., 1994; Chen și colab., 2009). Linia clonală US-1 a dominat un teritoriu extins al Asiei la sfârșitul anilor 90 - începutul anilor 2000. aproape pretutindeni au început să fie înlocuite cu alte genotipuri, care, la rândul lor, au cedat locul altora noi. În majoritatea cazurilor, schimbările în structura și compoziția populațiilor din țările asiatice au fost asociate cu migrarea de noi genotipuri din exterior. Deci, în Japonia, cu excepția genotipului JP-3, toate celelalte genotipuri japoneze care au apărut după US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) au o origine externă mai mult sau mai puțin dovedită (Akino și colab. , 2011) ... În prezent, există trei populații principale de agenți patogeni în China, care au o diviziune geografică clară; Nu există sau există un flux de gene foarte slab între aceste populații (Guo și colab., 2010; Li și colab., 2013b). Genotipul 13_A2 a apărut pe teritoriul Chinei în provinciile sale de sud (Yunnan și Sichuan) în 2005-2007 și în 2012-1014. a fost văzut și în nord-estul țării (Li și colab., 2013b). În India, 13_A2 a apărut probabil în același timp ca și în China, cel mai probabil cu cartofi de semințe infectați (Chowdappa și colab., 2015) și în 2009-2010. a provocat o epifitoză gravă a bolii târzii la tomate în sudul țării, după care s-a răspândit la cartofi și în 2014 a provocat un focar de boala târzie în Bengalul de Vest, care a dus la ruina și sinuciderea multor fermieri locali (Fry, 2016 ).
Africa
Până în 2008-2010 nu au fost efectuate studii sistematice ale P. infestans în țările africane. În prezent, populațiile africane de P. infestans pot fi împărțite în două grupuri, iar această diviziune este în mod clar asociată cu importul de cartofi de sămânță din Europa.
În Africa de Nord, care importă activ cartofi de sămânță din Europa, tipul de împerechere A2 este reprezentat pe scară largă în aproape toate regiunile, ceea ce oferă o posibilitate teoretică de apariție a unor noi genotipuri ca urmare a recombinării sexuale (Corbière și colab., 2010; Rekad și colab., 2017). În plus, în Algeria, prezența genotipurilor 13_A2, 2_A1 și 23_A1 este remarcată cu o pronunțare pronunțată a primului dintre ele, precum și o scădere treptată a proporției genotipurilor unice până la dispariția completă (Rekad și colab., 2017 ). Spre deosebire de restul regiunii, în Tunisia (cu excepția nord-estului țării), populația de agenți patogeni este reprezentată în principal de tipul de împerechere A1 (Harbaoui și colab., 2014).
Linia clonală NA-01 este dominantă aici. În general, proporția liniilor clonale în populație este de numai 43%. În Africa de Est și de Sud, unde volumul importurilor de semințe este foarte mic (Fry și colab., 2009), P. infestans este reprezentat doar de două linii clonale de tip A1, US-1 și KE-1, iar acesta din urmă activ îl deplasează pe primul pe cartofi (Pule și colab., 2012; Njoroge și colab., 2016). Până în prezent, ambele genotipuri au un număr vizibil de variații subclonale.
Australia
Primul raport despre boala târzie a cartofilor din Australia datează din 1907, iar prima epifitotie, probabil cauzată de ploile abundente în lunile de vară, a avut loc în 1909-1911. (Drenth și colab., 2002). Cu toate acestea, în general, boala târzie nu are o semnificație economică semnificativă pentru țară. Focarele sporadice de boli târzii, provocate de condițiile meteorologice care asigură umiditate ridicată, apar nu mai mult de o dată la 5-7 ani și sunt localizate în principal în nordul Tasmaniei și în centrul Victoria. În legătură cu cele de mai sus, publicațiile dedicate studiului structurii populației australiene de P. infestans sunt practic absente. Cele mai recente informații disponibile sunt din 1998-2000. (Drenth și colab., 2002). Potrivit autorilor, populația Victoria era o linie clonală US-1.3, ceea ce a confirmat indirect migrarea acestui genotip din Statele Unite. Specimenele tasmaniene au fost clasificate ca AU-3, diferit de genotipurile care erau prezente la acea vreme în alte părți ale lumii.
Caracteristici ale dezvoltării bolii târzii în Rusia
În Europa, infecția a fost introdusă cu tuberculi de semințe bolnavi, oospori care au iernat în sol, precum și zoosporangia adusă de vânt din plantele crescute din tuberculii iernati în câmpurile de anul trecut (plante „voluntare”), sau pe grămezi de semn de carte sacrificate pentru depozitare de tuberculi. Dintre acestea, plantele cultivate pe grămezi de tuberculi aruncați sunt considerate cea mai periculoasă sursă de infecție. acolo, numărul tuberculilor încolțiți este adesea semnificativ, iar zoosporangia poate fi transportată de la ei pe distanțe mari. Restul surselor (oospori, plante „voluntare”) nu sunt atât de periculoase, deoarece nu se obișnuiește să crească plante în aceleași câmpuri mai des decât o dată la 3-4 ani. Infecția cu tuberculi de semințe bolnavi este, de asemenea, minimă datorită unui sistem de control al calității semințelor.
În general, cantitatea de inocul în populațiile europene este limitată și, prin urmare, creșterea epidemiei este destul de lentă și poate fi controlată cu succes folosind preparate fungicide chimice. Sarcina principală în condițiile europene este lupta împotriva infecțiilor în faza în care începe dispersia în masă a zoosporangiei de la plantele afectate.
În Rusia, situația este radical diferită. Cea mai mare parte a culturilor de cartofi și roșii este cultivată în mici grădini private; fie nu se efectuează deloc măsuri de protecție asupra acestora, fie tratamente fungicide se efectuează într-un număr insuficient și încep după apariția râului târziu pe vârfuri. Drept urmare, grădinile de legume private acționează ca sursă principală de infecție, din care zoosporangia este transportată de vânt către plantațiile comerciale. Acest lucru este confirmat de observațiile noastre directe din regiunile Moscova, Bryansk, Kostroma, Ryazan: daunele plantelor din grădinile private sunt observate chiar înainte de începerea tratamentelor fungicide ale plantațiilor comerciale. Ulterior, epidemia în câmpuri mari este limitată prin utilizarea preparatelor fungicide, în timp ce în grădinile private există o dezvoltare rapidă a bolii târzii.
În cazul tratamentelor necorespunzătoare sau „bugetare” ale plantărilor comerciale, în câmpuri apar, de asemenea, focare de boală târzie; mai târziu, acestea se dezvoltă activ, acoperind zone din ce în ce mai mari (Elansky, 2015). Infecția în grădinile private are un impact semnificativ asupra epidemiilor din domeniile comerciale. În toate regiunile de cultivare a cartofilor din Rusia, suprafața ocupată de cartofi în grădinile private este de câteva ori mai mare decât suprafața totală a câmpurilor marilor producători. Într-un astfel de mediu, grădinile de legume private pot fi privite ca o resursă globală de inocul pentru domeniile comerciale. Să încercăm să identificăm acele proprietăți care sunt caracteristice genotipurilor tulpinilor din grădinile private.
Plantarea controlului fără semințe și în carantină a cartofilor obișnuiți, semințelor de roșii obținute de la producători străini dubioși, cultivarea pe termen lung a cartofilor și roșiilor pe aceleași zone, tratamente necorespunzătoare cu fungicide sau absența completă a acestora duc la epifitotice severe în sectorul privat, rezultatul dintre care este traversarea liberă, hibridizarea și formarea de oospori în grădinile private. Ca rezultat, se observă o diversitate genotipică foarte mare a agentului patogen, când aproape fiecare tulpină este unică în genotipul său (Elansky și colab., 2001, 2015). Plantarea cartofilor de sămânță de diferite origini genetice face puțin probabil să apară linii clonale specializate să atace un anumit soi. Tulpinile selectate într-un astfel de caz se disting prin versatilitatea lor în raport cu soiurile afectate, cele mai multe dintre ele având un număr apropiat de numărul maxim de gene de virulență. Acest lucru este foarte diferit de sistemul de "linii clonale" tipic pentru câmpurile mari ale întreprinderilor agricole cu un sistem instalat corespunzător de protecție împotriva bolii târzii. „Liniile clonale” (când toate tulpinile patogenului târziu în câmp sunt reprezentate de unul sau mai multe genotipuri) sunt omniprezente în țările în care creșterea cartofului este realizată exclusiv de ferme mari: SUA, Olanda, Danemarca etc. Anglia, Irlanda, Polonia, unde parcelele gospodărești sunt, de asemenea, răspândite în mod tradițional, cultivând cartofi, există, de asemenea, o diversitate genotipică mai mare în grădinile private. La sfârșitul secolului al XX-lea, „liniile clonale” erau răspândite în regiunile asiatice și orientale îndepărtate ale Rusiei (Elansky și colab., 20), ceea ce se pare că se datorează utilizării acelorași soiuri de cartofi exclusiv pentru plantare. Recent, situația din aceste regiuni a început să se schimbe și spre o creștere a diversității genotipice a populațiilor.
Lipsa tratamentelor intensive cu preparate fungicide are o altă consecință directă - nu există acumulări de tulpini rezistente în grădini. Într-adevăr, rezultatele noastre arată că tulpinile rezistente la metalaxil se găsesc semnificativ mai puțin frecvent în grădinile private decât în plantațiile comerciale.
Apropierea apropiată a plantațiilor de cartofi și roșii, tipice grădinilor private, facilitează migrația tulpinilor dintre aceste culturi, ca urmare a faptului că, în ultimul deceniu, printre tulpinile izolate de cartofi, proporția tulpinilor care poartă gena pentru rezistență la soiurile de roșii cherry (T1), caracteristice anterior doar pentru tulpinile de „roșii”. Tulpinile cu gena T1 în cele mai multe cazuri sunt extrem de agresive atât pentru cartofi, cât și pentru roșii.
În ultimii ani, răul târziu pe roșii a început să apară în multe cazuri mai devreme decât pe cartofi. Răsadurile de roșii pot fi infestate de oospori în sol sau de oospori prezenți în semințele de roșii sau care se aderă la acestea (Rubin și colab., 2001). În ultimii 15 ani, un număr mare de semințe ambalate ieftine, în principal importate, au apărut în magazine, iar majoritatea micilor producători au trecut la utilizarea lor. Semințele pot aduce tulpini cu genotipuri tipice regiunilor de creștere. În viitor, aceste genotipuri sunt incluse în procesul sexual din grădinile private, ceea ce duce la apariția unor genotipuri complet noi.
Astfel, se poate afirma că grădinile private sunt un „topitor” global în care, ca urmare a schimbului de material genetic, genotipurile existente sunt prelucrate și apar altele complet noi. În același timp, selecția lor are loc în condiții care sunt foarte diferite de cele create pentru cartofi în fermele mari: absența presei fungicide, uniformitatea varietală a plantațiilor, predominanța plantelor afectate de diferite forme de infecție virală și bacteriană, proximitatea la roșii și nopți sălbatice, încrucișare activă și formare de oospori, posibilitatea ca oosporii să acționeze ca sursă de infecție pentru anul următor.
Toate acestea duc la o diversitate genotipică foarte mare a populațiilor din curtea din spate. În condițiile epifitotice din grădinile de legume, răsăritul târziu se răspândește foarte repede și se eliberează cantități uriașe de spori, care zboară către plantațiile comerciale din apropiere. Cu toate acestea, după ce au intrat în domeniile comerciale cu sistemul corect de tehnologie agricolă și protecție chimică, sporii care au ajuns practic nu au nicio ocazie de a iniția epifitotice în domeniu, care se datorează absenței liniilor clonice care sunt rezistente la fungicide și specializate pentru soiul cultivat.
O altă sursă de inocul primar pot fi tuberculii bolnavi prinși în răsaduri comerciale. Acești tuberculi au fost cultivați, de regulă, în câmpuri cu tehnologie agricolă bună și protecție chimică intensivă. Genotipurile izolatelor care infectează tuberculii sunt adaptate la dezvoltarea propriului soi. Aceste tulpini sunt semnificativ mai periculoase pentru plantarea comercială decât inoculul provenit din grădini private. Rezultatele cercetărilor noastre susțin, de asemenea, această presupunere. Populațiile izolate din câmpuri mari cu protecție chimică condusă corespunzător și tehnologie agricolă bună nu diferă prin diversitatea genotipică ridicată. Adesea acestea sunt câteva linii clonale care sunt extrem de agresive.
Tulpinile din materialul comercial din semințe pot pătrunde în populații din grădini de legume și pot fi implicate în procesele care se desfășoară în ele. Cu toate acestea, într-o grădină de legume, competitivitatea lor va fi mult mai mică decât într-un domeniu comercial și în curând vor înceta să mai existe sub forma unei linii clonale, dar genele lor pot fi utilizate în populația „grădină”.
Infecția care se dezvoltă pe plante „voluntare” și pe grămezi de tuberculi sacrificați în timpul recoltării nu este atât de relevantă pentru Rusia, deoarece În principalele regiuni de cultivare a cartofilor din Rusia, se observă înghețarea profundă a solului de iarnă, iar plantele din tuberculi care au iernat în sol rareori se dezvoltă. Mai mult, așa cum arată experimentele noastre, agentul patogen târziu nu supraviețuiește la temperaturi negative chiar și pe tuberculi care și-au păstrat viabilitatea. În zona aridă, unde se practică cultivarea cartofilor timpurii, boala târzie este destul de rară din cauza sezonului de creștere uscat și cald.
Astfel, observăm în prezent divizarea populațiilor de P. infestans în populații de „câmp” și „grădină”. Cu toate acestea, în ultimii ani, au fost observate procese care conduc la convergența și interpenetrarea genotipurilor din aceste populații.
Printre acestea, se poate remarca o creștere generală a alfabetizării micilor producători, apariția pachetelor mici accesibile de cartofi de sămânță, răspândirea preparatelor fungicide în pachete mici și pierderea fricii de „chimie” de către populație.
Situațiile apar atunci când, datorită activității viguroase a unui furnizor, sate întregi sunt plantate cu tuberculi de semințe de același soi și prevăzute cu pachete mici de aceleași pesticide. Se poate presupune că cartofii de același soi vor fi găsiți în plantațiile comerciale din apropiere.
Pe de altă parte, unele companii de comercializare a pesticidelor promovează scheme „bugetare” de tratare chimică. În acest caz, numărul de tratamente recomandate este subestimat și sunt oferite cele mai ieftine fungicide, iar accentul nu se pune pe prevenirea apariției bolii târzii până la tunderea vârfurilor, ci pe o anumită întârziere a epifitotului pentru a crește randamentul. Astfel de scheme sunt justificate din punct de vedere economic atunci când se cultivă cartofi obișnuiți din semințe de calitate inferioară, când, în principiu, nu se pune problema obținerii unui randament ridicat. Cu toate acestea, în acest caz, spre deosebire de populațiile din grădină, fundalul genetic nivelat al cartofului contribuie la selectarea raselor fiziologice specifice, care sunt foarte periculoase pentru acest soi.
În general, tendințele spre convergența metodelor de „grădină” și „câmp” de producție a cartofilor ni se par destul de periculoase. Pentru a preveni consecințele negative ale acestora, atât în sectorul casnic, cât și în cel comercial, va fi necesar să se controleze atât sortimentul de cartofi de sămânță, cât și gama de fungicide oferite proprietarilor privați în ambalaje mici, precum și urmărirea schemelor de protecție a cartofului și utilizarea preparate fungicide în sectorul comercial.
În zonele din sectorul privat, există o dezvoltare intensivă a bolii târzii, dar și a Alternaria. Cei mai mulți proprietari de parcele de uz casnic private nu iau măsuri speciale pentru a proteja împotriva Alternaria, luând dezvoltarea Alternaria pentru ofilirea naturală a frunzelor sau dezvoltarea bolii târzii. Prin urmare, odată cu dezvoltarea masivă a Alternaria pe soiuri sensibile, parcelele casnice pot servi ca sursă de inocul pentru plantațiile comerciale.
Mecanisme de variabilitate
Procesul de mutație
Deoarece apariția mutațiilor este un proces aleatoriu care se desfășoară cu o frecvență scăzută, apariția mutațiilor la orice locus depinde de frecvența mutației acestui locus și de mărimea populației. Atunci când se studiază frecvența mutațiilor tulpinilor de P. infestans, se determină de obicei numărul coloniilor crescute pe medii nutritive selective după tratamentul cu mutageni chimici sau fizici. După cum se poate vedea din datele prezentate în tabelul 8, frecvența mutației aceleiași tulpini la loci diferiți poate diferi cu mai multe ordine de mărime. Frecvența ridicată a mutațiilor în rezistența la metalaxil poate fi unul dintre motivele pentru acumularea de tulpini rezistente la acesta în natură.
Frecvența mutațiilor spontane sau induse, calculată pe baza experimentelor de laborator, nu corespunde întotdeauna proceselor care apar în populațiile naturale, din următoarele motive:
1. În cazul fisiunilor nucleare asincrone, este imposibil să se estimeze frecvența mutațiilor la o singură generație nucleară. Prin urmare, majoritatea experimentelor furnizează informații doar direct despre frecvența mutațiilor, fără a face distincția între două evenimente mutaționale și un eveniment care urmează mitozei.
2. Mutațiile dintr-o singură etapă reduc de obicei echilibrul genomului, prin urmare, odată cu dobândirea unei noi proprietăți, capacitatea generală a organismului scade. Majoritatea mutațiilor obținute experimental au o agresivitate redusă și nu sunt înregistrate la populațiile naturale. Astfel, coeficientul de corelație dintre gradul de rezistență al mutanților P. infestans la fungicidele fenilamidice și rata de creștere pe un mediu artificial a fost în medie (-0,62), iar rezistența la fungicide și agresivitatea pe frunzele de cartof (-0,65) (Derevyagina și colab., 1993), care indică aptitudinea redusă a mutanților. Mutațiile rezistenței la dimetomorf au fost, de asemenea, însoțite de o scădere bruscă a viabilității (Bagirova și colab., 2001).
3. Majoritatea mutațiilor spontane și induse sunt recesive și nu se manifestă fenotipic în experimente, ci constituie o rezervă ascunsă de variabilitate în populațiile naturale. Tulpinile mutante izolate în experimentele de laborator poartă mutații dominante sau semi-dominante (Kulish și Dyakov, 1979). Aparent, diploidia nucleară explică încercările nereușite de a obține mutanți sub influența iradierii UV care sunt virulente asupra soiurilor rezistente anterior (McKee, 1969). Conform calculelor autorului, astfel de mutații pot apărea cu o frecvență mai mică de 1: 500000. Tranziția mutațiilor recesive la o stare homozigotă, exprimată fenotipic, poate avea loc din cauza recombinării sexuale sau asexuale (vezi mai jos). Cu toate acestea, chiar și în acest caz, mutația poate fi mascată de alelele dominante ale nucleilor de tip sălbatic din miceliul cenotic (multinucleat) și fixată fenotipic numai în timpul formării zoosporilor mononucleari.
Tabelul 8. Frecvența mutațiilor P. infestans la substanțele care inhibă creșterea sub acțiunea nitrosometilureei (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova și colab., 2001)
compus | Frecvența mutației |
Oxitetraciclină | 6,9 10 X-8 |
Blasticidină S | 7,2 x 10-8 |
Streptomicină | 8,3 x10-8 |
Trichothecin | 1,8 10 X-8 |
Cicloheximidă | 2,1 10 X-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimetomorf | 6,3 10 X-7 |
Metalaxil | 6,9 10 X-6 |
Mărimea populației joacă, de asemenea, un rol decisiv în apariția mutațiilor spontane. La populații foarte mari, în care numărul de celule N> 1 / a, unde a este rata mutației, mutația încetează să mai fie un fenomen aleatoriu (Kvitko, 1974).
Calculele arată că, cu o infestare medie a unui câmp de cartofi (35 de pete pe plantă), se formează 8x1012 spori zilnic pe un hectar (Dyakov și Suprun, 1984). Aparent, astfel de populații conțin toate mutațiile permise de tipul de schimb la fiecare locus. Chiar și o mutație rară, care apare cu o frecvență de 10-9, va fi dobândită de o mie de indivizi din milioanele care trăiesc pe un hectar dintr-un câmp de cartofi. Pentru mutațiile care apar cu o frecvență mai mare (de exemplu, 10-6), într-o astfel de populație, pot apărea zilnic diferite mutații asociate (simultan la două loci), adică procesul de mutație va înlocui recombinarea.
Migrații
Pentru P. infestans, sunt cunoscute două tipuri principale de migrație: închiderea distanțelor (într-un câmp de cartofi sau câmpuri învecinate) prin răspândirea zoosporangiei prin curenți de aer sau spray de ploaie și pe distanțe lungi - cu plantarea de tuberculi sau fructe de roșii transportate. Prima metodă prevede extinderea focalizării bolii, a doua - crearea de noi focare în locuri îndepărtate de primar.
Răspândirea infecției cu tuberculi și fructe de roșii nu numai că contribuie la apariția bolii în locuri noi, ci este și principala sursă de diversitate genetică a populațiilor. În regiunea Moscovei, se cultivă cartofi, aduși din diferite regiuni din Rusia și Europa de Vest. Fructele de roșii sunt aduse din regiunile sudice ale Rusiei (regiunea Astrakhan, teritoriul Krasnodar, Caucazul de Nord). Semințele de roșii, care pot servi și ca surse de infecție (Rubin și colab., 2001), sunt, de asemenea, importate din regiunile sudice ale Rusiei, Chinei, țărilor europene și din alte țări.
Conform calculelor lui E. Mayr (1974), modificările genetice dintr-o populație locală cauzate de mutații rareori depășesc 10-5 pe locus, în timp ce în populațiile deschise, schimbul datorat contracurentului de gene este de cel puțin 10-3 - 10 -4.
Migrația în tuberculi infectați este responsabilă de intrarea P. infestans în Europa, răspândindu-se în toate regiunile lumii în care se cultivă cartofi; au provocat cele mai grave modificări ale populației. Tăierea târzie a cartofilor a apărut pe teritoriul Imperiului Rus aproape simultan cu apariția sa în Europa de Vest.
Din moment ce boala a fost observată pentru prima dată în 1846-1847 în statele baltice și numai în anii următori răspândită în Belarus și în regiunile de nord-vest ale Rusiei, originea ei vest-europeană este evidentă. Prima sursă de boli târzii din Lumea Veche nu este atât de evidentă. Ipoteza dezvoltată de Fry și colab. (Fry și colab., 1992; Fry, Goodwin, 1995; Goodwin și colab., 1994) sugerează că parazitul a venit mai întâi din Mexic în America de Nord, unde s-a răspândit peste culturi și apoi a fost transportat în Europa de Vest (fig. 7).
Ca urmare a derivei repetate (efect dublu al „gâtuirii”), clonele individuale au ajuns în Europa, ale căror descendenți au provocat o pandemie pe întreg teritoriul lumii vechi, unde se cultivă cartofii. Ca dovadă a acestei ipoteze, autorii citează, în primul rând, omniprezența unui singur tip de împerechere (A1) și, în al doilea rând, omogenitatea genotipurilor tulpinilor studiate din diferite regiuni (toate se bazează pe markeri moleculari, inclusiv 2 izozimi loci, modele de amprentă ADN și structura ADN-ului mitocondrial sunt identice și corespund clonei US-1 descrisă în SUA). Cu toate acestea, unele date ridică îndoieli cu privire la cel puțin unele dintre prevederile ipotezei declarate. Analiza ADN-ului mitocondrial al P. infestans izolat din probele de cartofi din herbariu infectate în prima perioadă epifitotică din anii 40 a arătat că acestea diferă în structura ADN-ului mitocondrial din clona US-1, care, prin urmare, nu era cel puțin singura sursă de infecție în Europa (Ristaino et al, 2001).
Situația târzie s-a înrăutățit din nou în anii 80 ai secolului XX. Au avut loc următoarele modificări:
1) Agresivitatea medie a populației a crescut, ceea ce a condus, în special, la răspândirea pe scară largă a celei mai dăunătoare forme de boli târzii - deteriorarea pețiolilor și tulpinilor.
2) A existat o schimbare în timpul răului târziu la cartofi - de la sfârșitul lunii iulie la începutul lunii iulie și chiar la sfârșitul lunii iunie.
3) Tipul de împerechere A2, care anterior era absent în Lumea Veche, a devenit omniprezent.
Schimbările au fost precedate de două evenimente: utilizarea masivă a noului fungicid metalaxil (Schwinn și Staub, 1980) și apariția Mexicului ca exportator mondial de cartofi (Niederhauser, 1993). În conformitate cu aceasta, au fost prezentate două motive pentru modificările populației - conversia tipului de împerechere sub influența metalaxilului (Ko, 1994) și introducerea masivă de noi tulpini cu tuberculi infectați din Mexic (Fry și Goodwin, 1995). Deși interconversiile tipurilor de împerechere sub influența metalaxilului au fost obținute nu numai de Ko, ci și în lucrările efectuate în laboratorul Universității de Stat din Moscova (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), a doua ipoteză este preferabilă. Odată cu apariția celui de-al doilea tip de împerechere, au avut loc schimbări grave în genotipurile tulpinilor rusești de P. infestans, inclusiv în genele neutre (izozima și locurile RFLP), precum și în structura ADN-ului mitocondrial. Complexul acestor schimbări nu poate fi explicat prin acțiunea metalaxilului; mai degrabă, a existat un import masiv de noi tulpini din Mexic, care, fiind mai agresivi (Kato și colab., 1997), au deplasat vechile tulpini (SUA-1) , devenind dominantă în populații. Schimbarea compoziției populațiilor europene a avut loc într-un timp foarte scurt - din 1980 până în 1985 (Fry și colab., 1992). Pe teritoriul fostei URSS, „noi tulpini” au fost găsite în colecțiile din Estonia în 1985, adică mai devreme decât în Polonia și Germania (Goodwin și colab., 1994). Ultima dată când „vechea tulpină US-1” din Rusia a fost izolată de o roșie infectată din regiunea Moscovei în 1993 (Dolgova și colab., 1997). Tot în Franța, tulpini „vechi” au fost găsite în plantările de roșii până la începutul anilor '90, adică după ce au dispărut mult timp pe cartofi (Leberton și Andrivon, 1998). Modificările tulpinilor de P. infestans au afectat multe trăsături, inclusiv cele de mare importanță practică, și au crescut nocivitatea bolii târzii.
Recombinarea sexuală
Pentru ca recombinarea sexuală să contribuie la variabilitate, este necesară, în primul rând, prezența a două tipuri de împerechere în populație într-un raport apropiat de 1: 1 și, în al doilea rând, prezența variabilității inițiale a populației.
Raportul tipurilor de împerechere variază foarte mult în diferite populații și chiar în ani diferiți într-o populație (Tabelul 9,10, 90). Motivele unor astfel de schimbări drastice în frecvența tipurilor de împerechere în populații (cum ar fi, de exemplu, în Rusia sau în Israel la începutul anilor 2002 ai secolului trecut) sunt necunoscute, dar se crede că acest lucru se datorează introducerii unor clone competitive (Cohen, XNUMX).
Unele date indirecte indică evoluția procesului sexual în anii și în anumite regiuni:
1) Studiile populațiilor din regiunea Moscovei au arătat că, în 13 populații în care proporția tipului de împerechere A2 a fost mai mică de 10%, diversitatea genetică totală calculată pentru trei loci de izozimă a fost de 0,08 și în 14 populații în care proporția A2 a depășit 30%, diversitatea genetică a fost de două ori mai mare (0,15) (Elansky și colab., 1999). Astfel, cu cât este mai mare probabilitatea actului sexual, cu atât este mai mare diversitatea genetică a populației.
2) Relația dintre raportul dintre tipurile de împerechere în populații și intensitatea formării de oospori a fost observată în Israel (Cohen și colab., 1997) și în Olanda.
(Flier și colab., 2004). Studiile noastre au arătat că, în populațiile în care izolatele cu tipul de împerechere A2 reprezentau 62, 17, 9 și 6%, s-au găsit oospori în 78, 50, 30 și 15% din frunzele de cartof analizate (având 2 sau mai multe pete), respectiv.
Eșantioanele cu 2 sau mai multe pete au conținut semnificativ mai des oospori decât eșantioanele cu 1 pete (respectiv 32% și 14% din probe) (Apryshko și colab., 2004).
Oosporii erau mult mai frecvenți în frunzele stratului mediu și inferior al plantei de cartof (Mytsa și colab., 2015; Elansky și colab., 2016).
3) În unele regiuni, au fost descoperite genotipuri unice, a căror apariție este asociată cu recombinarea sexuală. Astfel, în Polonia în 1989 și în Franța în 1990, tulpini homozigote pentru glucoza-6-
fosfat izomerază (GPI 90/90). Deoarece anterior s-au întâlnit doar 10/90 heterozigoți timp de 100 ani, homozigoza este atribuită recombinării sexuale (Sujkowski și colab., 1994). În Columbia (SUA), izolatele care combină A2 cu GPI 100/110 și A1 cu GPI 100/100 sunt frecvente, cu toate acestea, la sfârșitul sezonului 1994 (16 august și 9 septembrie), tulpini cu genotipuri recombinate (A1 GPI 100 / 110 și A2 GPI 100/100) (Miller și colab., 1997).
4) La unele populații din Polonia (Sujkowski și colab., 1994) și din Caucazul de Nord (Amatkhanova și colab., 2004), distribuția locurilor ADN-ului de amprentă și a locurilor proteinelor alozimice corespunde distribuției Hardy-Weinberg, care indică
despre ponderea ridicată a contribuției recombinării sexuale la variabilitatea populațiilor. În alte regiuni din Rusia, nu s-a găsit nicio corespondență cu distribuția Hardy-Weinberg în populații, dar s-a arătat prezența dezechilibrului de legătură, indicând predominanța reproducerii clonale (Elansky și colab., 1999).
5) Diversitatea genetică (GST) între tulpini cu diferite tipuri de împerechere (A1 și A2) a fost mai mică decât între diferite populații (Sujkowski și colab., 1994), ceea ce indică indirect încrucișări sexuale.
În același timp, contribuția recombinării sexuale la diversitatea populației nu poate fi foarte mare. Această contribuție a fost calculată pentru populațiile din regiunea Moscovei (Elansky și colab., 1999). Conform calculelor lui Lewontin (1979) „recombinarea, care poate produce noi variante din două loci cu o frecvență care nu depășește produsul heterozigoților lor, devine efectivă numai dacă valorile heterozigoților pentru ambele alele sunt deja ridicate”.
Cu raportul celor două tipuri de împerechere, care este tipic pentru regiunea Moscovei, egal cu 4: 1, frecvența de recombinare este de 0,25. Probabilitatea ca tulpinile încrucișate să fie heterozigote pentru două dintre cele trei loci izozigote studiate în populațiile studiate a fost de 0,01 (2 tulpini din 177). În consecință, probabilitatea apariției heterozigoților dubli ca rezultat al recombinării nu trebuie să depășească produsul lor înmulțit cu probabilitatea de încrucișare (0,25x0,02x0,02) = 10-4, adică recombinantele sexuale nu se încadrează de obicei în eșantionul studiat de tulpini. Aceste calcule au fost făcute pentru populațiile din regiunea Moscovei, care se caracterizează printr-o variabilitate relativ mare. La populațiile monomorfe precum cele siberiene, procesul sexual, chiar dacă are loc în populații separate, nu poate influența diversitatea genetică a acestora.
În plus, P. infestans se caracterizează prin frecventă nealiniere a cromozomilor în meioză, ceea ce duce la aneuploidie (Carter și colab., 1999). Astfel de încălcări reduc fertilitatea hibrizilor.
Recombinarea parasexuală, conversia genotică mitotică
În experimentele privind îmbinarea tulpinilor de P. infestans cu mutații de rezistență la diferiți inhibitori de creștere, s-a constatat apariția misolaților rezistenți la ambii inhibitori (Shattock și Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Tulpinile rezistente la doi inhibitori de creștere au apărut ca urmare a heterocariotizării miceliului și, în acest caz, au scindat în timpul reproducerii de către zoospori mononucleari (Judelson, Ge Yang, 1998) sau nu s-au scindat la descendenții monozoosporici, deoarece aveau tetraploid (din moment ce izolatele inițiale sunt diploide) nuclee (K, 1979). Diploizii heterozigoti segregați la o frecvență foarte scăzută datorită haploidizării, nedisjunctiei cromozomiale și traversării mitotice (Poedinok și colab., 1982). Frecvența acestor procese ar putea fi crescută cu ajutorul anumitor acțiuni asupra diploizilor heterozigoți (de exemplu, iradierea UV a sporilor germinați).
Deși formarea hibrizilor vegetativi cu dublă rezistență are loc nu numai in vitro, ci și la tuberculii de cartofi infectați cu un amestec de mutanți (Kulish și colab., 1978), este destul de dificil de evaluat rolul recombinării parasexuale în generația de genotipuri noi la populații. Frecvența formării de segreganți datorită haploidizării, nedisjunctiei cromozomilor și încrucișării mitotice fără efecte speciale este neglijabilă (mai puțin de 10-3).
Apariția unor segreganți homozigoti ai tulpinilor heterozigoți se poate baza atât pe încrucișarea mitotică, cât și pe conversia genică mitotică, care în P. sojae are loc cu o frecvență de 3 x 10-2 până la 5 x 10-5 per locus, în funcție de tulpină ( Chamnanpunt și colab., 2001).
Deși frecvența apariției heterocarionilor și a diploizilor heterozigoți s-a dovedit a fi neașteptat de mare (ajungând la zeci de procente), acest proces are loc numai atunci când culturile mutante obținute din aceeași tulpină sunt îmbinate. Când se utilizează diferite tulpini izolate de natură, heterocariotizarea nu are loc (sau are loc cu o frecvență foarte scăzută) din cauza prezenței incompatibilității vegetative (Poedinok și Dyakov, 1981; Anikina și colab., 1997b; Cherepennikova-Anikina și colab., 2002 ). În consecință, rolul recombinării parasexuale poate fi redus doar la recombinarea intraclonală în nucleii heterozigoți și trecerea genelor individuale la o stare homozigotă fără un proces sexual. Acest proces poate avea o semnificație epidemiologică la tulpinile cu mutații recesive sau semi-dominante de rezistență la fungicide. Trecerea sa la o stare homozigotă datorită procesului parasexual va crește rezistența purtătorului mutației (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgresia genelor
Speciile heterotalice Phytophthora sunt capabile să se încrucișeze cu formarea de oospori hibrizi (vezi Vorob'eva și Gridnev, 1983; Sansome și colab., 1991; Veld și colab., 1998). Hibridul natural al celor două specii Phytophthora a fost atât de agresiv încât a ucis mii de arini în Marea Britanie (Brasier și colab., 1999). P. infestans poate apărea cu alte specii din gen (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum etc.) pe plantele gazdă comune și în sol, dar există puține informații în literatura de specialitate despre posibilitatea hibrizilor interspecifici. . În condiții de laborator, s-au obținut hibrizi între P. infestans și P. Mirabilis (Goodwin și Fry, 1994).
Tabelul 9. Proporția tulpinilor de P. infestans cu tip de împerechere A2 în diferite țări ale lumii în perioada 1990-2000 (conform datelor surselor și site-urilor de literatură deschisă www.euroblight.net, www.eucablight.org)
țară | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Bielorusia | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgia | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estonia | 8 (12) | ||||||||||
Anglia | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finlanda | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Franța | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Ungaria | 72 (32) | ||||||||||
Irlanda | 4 (145) | ||||||||||
Nord. Irlanda | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Țările de Jos | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norvegia | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polonia | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Scoția | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Suedia | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Coreea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
China | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Columbia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Maroc | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mexic (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabelul 10. Proporția tulpinilor de P. infestans cu tip de împerechere A2 în diferite țări ale lumii în perioada 2000 - 2011
țară | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austria | 65 (83) | ||||||||||
Bielorusia | 42 (78) | ||||||||||
Belgia | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Elveția | 89 (19) | ||||||||||
Cehia | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Germania | 95 (53) | ||||||||||
Danemarca | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estonia | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Anglia | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finlanda | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Franța | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Ungaria | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Nord. Irlanda | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Țările de Jos | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norvegia | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Polonia | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Scoția | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Suedia | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovacia | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Coreea | 46 (26) | ||||||||||
Brazilia | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
China | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dinamica compoziției genotipice a populațiilor
Modificări ale compoziției genotipice a populațiilor de P. infestans pot apărea sub influența migrației noilor clone din alte regiuni, a practicilor agricole (schimbarea soiurilor, aplicarea fungicidelor) și a condițiilor meteorologice. Influențele externe afectează în mod diferit clonele la diferite etape ale ciclului de viață; prin urmare, populațiile experimentează anual modificări ciclice în frecvența genelor supuse selecției, datorită unei modificări a rolului predominant al derivei și selecției genelor.
Influența soiului
Soiurile noi cu gene eficiente pentru rezistență verticală (gene R) sunt un factor selectiv puternic, selectând clone cu gene de virulență complementare în populațiile de P. infestans. În absența unei rezistențe nespecifice în soiul de cartofi, care inhibă creșterea populației de agenți patogeni, procesul de înlocuire a clonelor dominante din populație are loc foarte repede. Astfel, după răspândirea în regiunea Moscovei a soiului Domodedovsky, care are gena de rezistență R3, frecvența clonelor virulente pentru acest soi a crescut de la 0,2 la 0,82 într-un an (Dyakov și Derevjagina, 2000).
Cu toate acestea, schimbarea frecvențelor genelor de virulență (patotipuri) la populații are loc nu numai sub influența soiurilor de cartof cultivate. De exemplu, în Belarus până în 1977, au dominat clonele cu genele de virulență 1 și 4, care au fost cauzate de cultivarea soiurilor de cartofi cu gene de rezistență R1 și R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Cu toate acestea, la sfârșitul anilor 70 ai secolului XX, au apărut clone cu diferite gene de virulență și combinațiile lor, iar genele de rezistență complementare nu au fost niciodată utilizate în reproducerea cartofilor (gene de extra virulență) (Ivanyuk și colab., 2002). Motivul apariției unor astfel de clone, se pare, se datorează migrării în Europa a materialului infecțios din Mexic cu tuberculi de cartofi. Acasă, aceste clone s-au dezvoltat nu numai pe cartofi cultivați, ci și pe specii sălbatice care poartă o varietate de gene de rezistență; prin urmare, combinația multor gene de virulență din genom a fost necesară pentru supraviețuirea în aceste condiții.
În ceea ce privește soiurile cu rezistență nespecifică, acestea, prin reducerea ratei de reproducere a agentului patogen, întârzie evoluția populațiilor sale, care, după cum sa menționat deja, este o funcție a numărului. Deoarece agresivitatea este poligenică, clonele care conțin un număr mai mare de gene pentru „agresivitate” se acumulează cu cât mai devreme cu atât este mai mare dimensiunea populației. Prin urmare, rasele extrem de agresive nu sunt un produs de adaptare la soiurile cultivate cu rezistență nespecifică, ci, dimpotrivă, sunt mai susceptibile de a fi detectate în plantările de soiuri foarte sensibile care sunt acumulatori ai sporilor paraziți.
Astfel, în Rusia, cele mai agresive populații de P. Infestans au fost găsite în zone de epifitotie anuală (populații din regiunile Sahalin, Leningrad și Bryansk). Agresivitatea acestor populații s-a dovedit a fi mai mare decât a celor din Mexic (Filippov și colab., 2004).
În plus, în frunzele soiurilor rezistente se formează mai puțini oospori decât în cele susceptibile (Hanson și Shattock, 1998), adică rezistența nespecifică a soiului reduce, de asemenea, capacitățile de recombinare a parazitului și posibilitatea unor metode alternative de iernare.
Influența fungicidelor
Fungicidele nu numai că reduc numărul de ciuperci fitopatogene, adică afectează caracteristicile cantitative ale populațiilor lor, dar pot schimba și frecvența genotipurilor individuale, adică influențează compoziția calitativă a populațiilor. Printre cei mai importanți indicatori ai populației care se schimbă sub influența fungicidelor se numără următorii: modificări ale rezistenței la fungicide, modificări ale agresivității și virulenței și modificări ale sistemelor de reproducere.
Influența fungicidelor asupra rezistenței și agresivității populațiilor
Gradul unei astfel de influențe este determinat, în primul rând, de tipul de fungicid utilizat, care poate fi împărțit condiționat în polisit, oligozit și monosit.
Primul include majoritatea fungicidelor de contact. Rezistența la ele (dacă este posibilă) este controlată de un număr mare de gene foarte slab expresive. Aceste proprietăți determină absența modificărilor vizibile ale rezistenței populației după tratamentul cu fungicide (deși în unele experimente s-a obținut o creștere a rezistenței). Populația fungică conservată după pulverizarea cu fungicide de contact este formată din două grupuri de tulpini:
1) Tulpini conservate în zone de plante netratate cu medicamentul. Deoarece nu a existat niciun contact cu fungicidul, agresivitatea și rezistența acestor tulpini nu se schimbă.
2) Tulpini în contact cu fungicidul, a căror concentrație la punctele de contact a fost mai mică decât letală. Așa cum s-a menționat mai sus, rezistența acestei părți a populației nu se modifică, totuși, din cauza efectului dăunător parțial al fungicidului chiar și în concentrație subletală asupra metabolismului celulei fungice, starea generală de fitness și componenta sa parazitară, agresivitatea, scădere (Derevyagina și Dyakov, 1990).
Astfel, chiar și o parte a populației care nu a murit, expusă la contactul cu fungicidul, are o agresivitate slabă și nu poate fi o sursă de epifitotice. Prin urmare, prelucrarea atentă, care reduce frecvența proporției populației care nu este în contact cu fungicidul, este o condiție pentru succesul măsurilor de protecție. Rezistența la fungicidele oligozitice este controlată de mai multe gene aditive.
Mutația fiecărei gene duce la o oarecare creștere a rezistenței, iar gradul general de rezistență se datorează adăugării unor astfel de mutații. Prin urmare, creșterea rezistenței are loc în etape. Un exemplu de creștere treptată a rezistenței sunt mutațiile rezistenței la dimetomorful fungicid, care este utilizat pe scară largă pentru a proteja cartofii de boala târzie. Rezistența la dimetomorf este poligenică și aditivă. Mutația cu un singur pas crește ușor rezistența.
Fiecare mutație ulterioară scade dimensiunea țintă și, în consecință, frecvența mutațiilor ulterioare (Bagirova și colab., 2001). Creșterea rezistenței medii a populației după mai multe tratamente cu fungicid oligozit are loc treptat și treptat. Rata acestui proces este determinată de cel puțin trei factori: frecvența mutației genelor de rezistență, coeficientul de rezistență (raportul dintre doza letală a unei tulpini rezistente în raport cu una sensibilă) și efectul mutațiilor în rezistență gene despre fitness.
Frecvența apariției fiecărei mutații ulterioare este mai mică decât cea precedentă; prin urmare, procesul are un caracter de amortizare (Bagirova și colab., 2001). Cu toate acestea, dacă procesele de recombinare (sexuale sau parasexuale) apar în populație, atunci este posibil să se combine diferite mutații ale părinților într-o tulpină hibridă și să se accelereze procesul. Prin urmare, populațiile panmix dobândesc rezistență mai rapid decât cele agamice, iar în acestea din urmă, populațiile care nu au bariere de incompatibilitate vegetativă mai rapid decât populațiile împărțite de astfel de bariere. În acest sens, prezența tulpinilor la populațiile care diferă în ceea ce privește tipurile de împerechere accelerează procesul de dobândire a rezistenței la fungicidele oligozitice.
Al doilea și al treilea factor nu contribuie la acumularea rapidă a tulpinilor rezistente la dimetomorf în populații. Fiecare mutație ulterioară dublează aproximativ rezistența, ceea ce este nesemnificativ și, în același timp, reduce atât rata de creștere într-un mediu artificial, cât și agresivitatea (Bagirova și colab., 2001; Stem, Kirk, 2004). Poate de aceea nu există practic tulpini rezistente printre tulpinile naturale de P. infestans, chiar și cele colectate din plantările de cartofi tratați cu dimetomorf.
O populație tratată cu un fungicid oligosit va consta, de asemenea, din două grupuri de tulpini: cele care nu au fost în contact cu fungicidul și, prin urmare, nu au modificat caracteristicile inițiale (dacă tulpinile rezistente se găsesc în acest grup, ele nu se vor acumula datorită la agresivitatea și competitivitatea mai ridicate a tulpinilor sensibile), și tulpinilor în contact cu concentrațiile subletale ale fungicidului. Printre acestea din urmă este posibilă acumularea de tulpini rezistente, deoarece aici au avantaje față de cele sensibile.
Prin urmare, atunci când se utilizează fungicide cu oligozit, nu este atât de important un tratament amănunțit, ci o concentrație mare de medicament, de câteva ori mai mare decât doza letală, deoarece cu mutageneză treptată, rezistența inițială a tulpinilor mutante este scăzută.
În cele din urmă, mutațiile rezistenței la fungicidele monosite sunt extrem de expresive, adică o mutație poate raporta un nivel ridicat de rezistență până la pierderea completă a sensibilității. Prin urmare, creșterea rezistenței populațiilor are loc foarte repede.
Un exemplu de astfel de fungicide sunt fenilamidele, inclusiv cel mai frecvent fungicid, metalaxilul. Mutațiile rezistenței la aceasta apar cu o frecvență ridicată, iar gradul de rezistență la mutanți este foarte mare - depășește tulpina sensibilă cu un factor de o mie sau mai mult (Derevyagina și colab., 1993). Deși rata de creștere și agresivitatea mutanților rezistenți scade pe fondul morții tulpinilor sensibile de la un fungicid sistemic, numărul populației rezistente crește rapid și, în paralel, agresivitatea acesteia crește. Prin urmare, după câțiva ani de utilizare a fungicidului, agresivitatea tulpinilor rezistente nu poate egala doar agresivitatea celor sensibile, ci o poate depăși (Derevyagina și Dyakov, 1992).
Impactul asupra recombinării sexuale
Deoarece apariția frecventă a tipului de împerechere A2 la populațiile de P. infestans a coincis cu utilizarea intensivă a metalaxilului împotriva bolii târzii, sa presupus că metalaxilul induce conversia tipului de împerechere. În P. parasitica, o astfel de conversie sub acțiunea Chloroneb și metalaxil a fost dovedită experimental (Ko, 1994). Un singur pasaj pe un mediu cu o concentrație scăzută de metalaxil a condus la apariția izolatelor homotalice dintr-o tulpină de P. infestans sensibilă la metalaxil cu împerecherea tip A1 (Savenkova și Cherepnikova-Anikina, 2002). În timpul pasajelor ulterioare pe medii cu o concentrație mai mare de metalaxil, nu a fost detectat niciun izolat de tipul de împerechere A2, cu toate acestea, majoritatea izolatelor, atunci când au fost traversate cu izolate A2, în loc de oospori, au format acumulări urâte de miceliu și au fost sterile. Trecerile unei tulpini rezistente având tipul de împerechere A2 pe medii cu o concentrație mare de metalaxil ne-au permis să detectăm trei forme de modificări ale tipului de împerechere: 1) sterilitate completă atunci când sunt încrucișate cu izolate A1 și A2; 2) homotalism (formarea de oospori în monocultură); 3) conversia tipului de împerechere A2 în A1. Astfel, metalaxilul poate provoca modificări ale tipurilor de împerechere la populațiile de P. infestans și, în consecință, recombinare sexuală la acestea.
Influența asupra recombinării vegetative
Unele gene pentru rezistența la antibiotice au crescut frecvența heterocariotizării hifale și a diploidizării nucleare (Poedinok și Dyakov, 1981). După cum sa menționat anterior, heterocariotizarea hifelor în timpul fuziunii diferitelor tulpini de P. infestans apare foarte rar din cauza fenomenului de incompatibilitate vegetativă în această ciupercă. Cu toate acestea, genele pentru rezistența la unele antibiotice pot avea efecte secundare, exprimate în depășirea incompatibilității vegetative. Această proprietate a fost posedată de gena de rezistență la streptomicină mutantă 1S-1. Prezența unor astfel de mutanți în populațiile de câmp de phytophthora poate crește fluxul de gene între tulpini și poate accelera adaptarea întregii populații la noi soiuri sau fungicide.
Anumite fungicide și antibiotice pot influența frecvența recombinării mitotice, care poate modifica și frecvențele genotipului la populații. Fungicidul utilizat pe scară largă se leagă de beta-tubulină, o proteină din care sunt construiți microtubuli ai citoscheletului și perturbă astfel procesele de separare a cromozomilor în anafaza mitozei, crescând frecvența recombinării mitotice (Hastie, 1970).
Fungicidul para-fluorofenilalanină, utilizat pentru tratarea bolii olandeze la ulmi, are aceeași proprietate. Para-fluorofenilalanina a crescut frecvența recombinării în diploizii heterozigoți P. infestans (Poedinok și colab., 1982).
Modificări ciclice în compoziția genotipică a populațiilor în ciclul de viață al P. infestans
Ciclul clasic de dezvoltare a P. infestans în zona temperată este format din 4 faze.
1) Faza de creștere exponențială a populației (faza policiclică) cu generații scurte. Această fază începe de obicei în iulie și durează 1,5-2 luni.
2) Faza de oprire a creșterii populației din cauza unei scăderi accentuate a proporției de țesut neafectat sau a apariției condițiilor meteorologice nefavorabile. Această fază în fermele care efectuează îndepărtarea timpurie a frunzelor înainte de recoltare scade din ciclul anual.
3) Faza iernării în tuberculi, însoțită de o scădere semnificativă a dimensiunii populației din cauza infecției accidentale a tuberculilor, dezvoltarea lentă a infecției la aceștia, absența reinfecției tuberculilor, putrezirea și eliminarea tuberculilor afectați în condiții normale de depozitare condiții.
4) Faza de dezvoltare lentă în sol și pe răsaduri (faza monociclică), în care durata generației poate ajunge la o lună sau mai mult (sfârșitul lunii mai - începutul lunii iulie). De obicei, în acest moment, frunzele bolnave sunt dificil de detectat chiar și cu observații speciale.
Faza de creștere exponențială a populației (faza policiclică)
Numeroase observații (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) au arătat că la începutul epifitotipului predomină clonele cu virulență scăzută și ușor agresive, care sunt înlocuite ulterior. de altele mai virulente și mai agresive.viteza de creștere a agresivității populației este cu atât mai mare, cu cât varietatea plantei gazdă este mai puțin rezistentă.
Pe măsură ce populația crește, crește concentrația atât a genelor selectiv importante introduse în soiurile comerciale (R1-R4), cât și selectiv neutre (R5-R11). Deci, în populațiile din apropierea Moscovei în 1993, virulența medie de la sfârșitul lunii iulie până la jumătatea lunii august a crescut de la 8,2 la 9,4, iar cea mai mare creștere a fost observată pentru gena de virulență R5 selectiv neutră (de la 31 la 86% din clonele virulente) ( Smirnov, 1996).
O scădere a ratei de creștere a unei populații este însoțită de o scădere a activității parazitare a populației. Prin urmare, în anii depresivi, atât numărul total de rase, cât și proporția de rase extrem de virulente sunt mai mici decât în cele epifitotice (Borisenok, 1969). Dacă la înălțimea condițiilor meteorologice epifitotice se schimbă în nefavorabile pentru boala târzie și infestarea cu cartofi scade, concentrația clonelor extrem de virulente și agresive scade, de asemenea (Rybakova și colab., 1987).
Creșterea frecvenței genelor care afectează virulența și agresivitatea populației se poate datora selecției unor clone mai virulente și agresive în populația mixtă. Pentru a demonstra selecția, a fost dezvoltată o metodă de analiză a mutațiilor neutre, care a fost utilizată cu succes în populațiile de chemostat de drojdie (Adams și colab., 1985) și Fusarium graminearum (Wiebe și colab., 1995).
Frecvența mutanților rezistenți la blasticidina S în populația de câmp a P. infestans a scăzut în paralel cu creșterea agresivității populației, ceea ce indică o schimbare a clonelor dominante în procesul de creștere a populației (Rybakova și colab., 1987 ).
Faza de iernare în tuberculi
În timpul iernării în tuberculi de cartof, virulența și agresivitatea tulpinilor de P. infestans scad, iar scăderea virulenței are loc mai lent decât agresivitatea (Rybakova și Dyakov, 1990). Aparent, în condiții favorabile creșterii rapide a dimensiunii populației (selecție r), genele de virulență „extra” și agresivitatea ridicată sunt utile, prin urmare dezvoltarea epifitotică este însoțită de selectarea celor mai virulente și agresive clone. În condiții de saturație a mediului, atunci când nu rata reproducerii, ci persistența existenței în condiții nefavorabile (selecția K) joacă un rol important, genele „suplimentare” de virulență și agresivitate reduc condiția fizică, iar clonele cu aceste gene sunt primul care a dispărut, astfel încât agresivitatea medie și virulența populației scade.
Faza de vegetație în sol
Această fază este cea mai misterioasă din ciclul de viață (Andrivon, 1995). Existența sa a fost postulată pur speculativ - din cauza lipsei de informații despre ceea ce se întâmplă cu agentul patogen pe o perioadă lungă (uneori mai mult de o lună) - de la apariția răsadurilor de cartofi până la apariția primelor pete ale bolii pe ele. Pe baza observațiilor și experimentelor, comportamentul ciupercii în această perioadă a vieții a fost reconstruit (Hirst și Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporularea ciupercii se poate forma pe tuberculii infectați din sol. Sporii rezultați germinează cu hife, care pot vegeta mult timp în sol. Sporii primari (formați pe tuberculi) și secundari (pe miceliul din sol) se ridică la suprafața solului prin curenți capilari, dar dobândesc capacitatea de a infecta cartofii numai după ce frunzele sale inferioare coboară și vin în contact cu suprafața solului. Astfel de frunze (și anume, primele pete ale bolii se găsesc pe ele) nu se formează imediat, ci după o creștere prelungită și dezvoltarea vârfurilor de cartofi.
Astfel, în ciclul de viață al P. infestans poate exista și faza de vegetație saprotrofică. Dacă în faza parazitară a ciclului de viață agresivitatea este cea mai importantă componentă a fitnessului, atunci în faza saprotrofică selecția vizează reducerea proprietăților parazite, așa cum se arată experimental pentru unele ciuperci fitopatogene (vezi Carson, 1993). Prin urmare, în această fază a ciclului, proprietățile agresive ar trebui pierdute cel mai intens. Dar până acum nu au fost efectuate experimente directe care să confirme ipotezele de mai sus.
Modificările sezoniere afectează nu numai proprietățile patogene ale P. infestans, ci și rezistența la fungicide, care crește în faza policiclică (în timpul epifitotiei) și scade în timpul depozitării de iarnă (Derevyagina și colab., 1991; Kadish și Cohen, 1992) . O scădere deosebit de intensă a rezistenței la metalaxil a fost observată în perioada dintre plantarea tuberculilor afectați și apariția primelor pete ale bolii pe câmp.
Specializarea intraspecifică și evoluția acesteia
P. infestans provoacă epidemii în două culturi importante din punct de vedere comercial, cartofi și roșii. Epifitotia pe cartofi a început la scurt timp după ce ciuperca a intrat în zone noi. Înfrângerea roșiilor a fost observată, de asemenea, la scurt timp după apariția infecției la cartofi, dar epifitotia la tomate a fost observată doar o sută de ani mai târziu - la mijlocul secolului al XX-lea. Iată ce scriu Hallegli și Niederhauser despre înfrângerea roșiilor în SUA
(1962): „Timp de aproximativ 100 de ani după epifitotipul sever din 1845, s-au făcut puține sau aproape deloc încercări de a obține soiuri de roșii rezistente. Deși boala târzie a fost înregistrată pentru prima dată pe roșii încă din 1848, nu a devenit obiectul unei atenții serioase a crescătorilor de pe această plantă până la un focar puternic al bolii în 1946. Pe teritoriul Rusiei, sângele târziu a fost înregistrat în secolul al XIX-lea. „Pentru o lungă perioadă de timp, cercetătorii nu au acordat atenție acestei boli, deoarece nu a provocat daune economice semnificative. Dar în anii 60-70. În Uniunea Sovietică se observă epifitotia secolului XX cu boala târzie, în special în regiunea Volga de Jos, Ucraina, Caucazul de Nord, Moldova ... ”(Balashova, 1979).
De atunci, boala de roșii cu boala târzie a devenit anuală, răspândită pe întreg teritoriul cultivării industriale și casnice și provoacă daune economice enorme acestei culturi. Ce s-a întâmplat? De ce a apărut prima apariție a parazitului pe cartofi și leziunea epifitotică a acestei culturi aproape simultan și de ce a durat un secol pentru ca epifitoticul să apară pe roșie? Aceste diferențe susțin o sursă de infecție mai degrabă decât mexicană decât sud-americană. Dacă specia Phytophthora infestans s-a format ca un parazit al speciilor mexicane purtătoare de tuberculi din genul Solanum, atunci este de înțeles de ce cartofii cultivați aparținând aceleiași secțiuni din gen ca speciile mexicane au fost atât de puternic afectați, dar din cauza absenței coevolutia cu parazitul, care nu a dezvoltat mecanisme de rezistenta specifica si nespecifica.
Roșia aparține unei secțiuni diferite a genului, tipul schimbului său are diferențe semnificative față de speciile tuberoase, prin urmare, în ciuda faptului că roșia nu se află în afara specializării alimentare a P. infestans, intensitatea înfrângerii sale a fost insuficientă pentru pierderi economice grave.
Apariția epifitotiei pe roșii se datorează modificărilor genetice grave ale parazitului, care au sporit capacitatea de adaptare (patogenitate) la parazitare. Credem că noua formă specializată pentru parazitarea roșiei este rasa T1 descrisă de M. Gallegly, care afectează soiurile de roșii cherry (Red Cherry, Ottawa), rezistente la rasa T0 răspândită pe cartofi (Gallegly, 1952). Aparent, o mutație (sau o serie de mutații) care a transformat cursa T0 în cursa T1 și a dus la apariția unor clone foarte adaptate la înfrângerea roșiei. Așa cum se întâmplă adesea, o creștere a patogenității la o gazdă a fost însoțită de scăderea acesteia la alta, adică a apărut o specializare intraspecifică inițială, încă nu completă - la cartofi (rasa T0) și la tomate (rasa T1).
Care este dovada acestei presupuneri?
- Apariție la cartofi și roșii. Pe frunzele de roșii predomină cursa T1, în timp ce pe frunzele de cartof este rară. Potrivit S.F. Bagirova și T.A. Oreshonkova (nepublicată) în regiunea Moscovei în 1991-1992, apariția rasei T1 în plantațiile de cartofi a fost de 0%, iar în plantațiile de roșii - 100%; în 1993-1995 - 33%, respectiv 90%; în 2001 - 0% și 67%. Date similare au fost obținute în Israel (Cohen, 2002). Experimentele cu infecția tuberculilor de cartofi cu izolate din rasa T1 și un amestec de izolate T0 și T1 au arătat că izolatele din rasa T1 sunt slab conservate în tuberculi și sunt înlocuite cu izolate din rasa T0 (Dyakov și colab., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dinamica rasei T1 în plantațiile de roșii. Infecția primară a frunzelor de roșii este efectuată de izolate din rasa T0, care domină în analiza infecției în primele pete formate pe frunze. Acest lucru confirmă schema general acceptată a migrației parazitului: masa principală de infecție din cartofi este alcătuită din rasa T0, cu toate acestea, un număr mic de clone T1 conservate în cartofi, odată pe roșii, deplasează rasa T0 și se acumulează către sfârșitul perioadei epifitotice. De asemenea, este posibil să existe o sursă alternativă de infecție a frunzelor de roșii cu rasa T1, nu la fel de puternică ca tuberculii și frunzele de cartofi, ci constantă. Prin urmare, această sursă are un efect slab asupra structurii genetice a populației care infectează roșiile, dar ulterior determină acumularea rasei T1 (Rybakova, 1988; Dyakov și colab., 1994).
3) Agresivitatea la cartofi și roșii. Infecția artificială a roșiilor și a frunzelor de cartof cu izolate din rasele T0 și T1 a arătat că primele sunt mai agresive pentru cartofi decât pentru tomate, iar cele din urmă sunt mai agresive pentru roșii decât pentru cartofi. Aceste diferențe se manifestă în deplasarea izolatelor unei rase non-proprii dintr-o populație mixtă în timpul pasajelor pe frunze într-o seră (Dyakov și colab., 1975) și în parcele de câmp (Leberton și colab., 1999); diferențe în sarcina infecțioasă minimă, perioada de latență, dimensiunea petelor infecțioase și producția de spori (Rybakova, 1988; Dyakov și colab., 1994; Legard și colab., 1995; Forbes și colab., 1997; Oyarzun și colab., 1998; Leberton și colab., 1999; Vega-Sanchez și colab., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna și colab., 2004).
Agresivitatea izolatelor din rasa T1 față de soiurile de roșii lipsite de gene de rezistență este atât de mare încât aceste izolate sporesc pe frunze ca pe un mediu nutritiv fără a necroza țesutul infectat (Dyakov și colab., 1975; Vega-Sanchez și colab., 2000) .
4) Virulența pentru cartofi și roșii. Rasa T1 afectează soiurile de roșii cherry cu gena de rezistență Ph1, în timp ce rasa T0 nu este capabilă să infecteze aceste soiuri, adică are o virulență mai îngustă. În raport cu diferențiatori
Genele R ale cartofilor sunt legate invers, adică tulpinile izolate din frunzele de roșii sunt mai puțin virulente decât tulpinile de „cartof” (Tabelul 11).
5) Markeri neutri. Analiza markerilor neutri la populațiile de P. infestans care parazitează pe cartofi și roșii mărturisește și despre selecția intraspecifică multidirecțională. În populațiile braziliene de P. infestans, izolatele de frunze de tomate au aparținut liniei clonale US-1, iar cele din frunzele de cartofi au aparținut liniei BR-1 (Suassuna și colab., 2004). În Florida (SUA), din 1994, clona US-90 a început să domine pe cartofi (cu o apariție de peste 8%), și clonele US-11 și US-17 pe roșii, iar izolatele din urmă sunt mai agresive pentru tomate decât pentru cartof (Weingartner, Tombolato, 2004). Diferențe semnificative în frecvențele genotipului (amprente ADN) în izolatele de cartofi și roșii au fost stabilite pentru 1200 tulpini de P. infestans colectate în Statele Unite din 1989 până în 1995 (Deahl și colab., 1995).
Folosirea metodei AFLP a făcut posibilă separarea a 74 de tulpini colectate din frunze de cartofi și roșii în 1996-1997. în Franța și Elveția, în 7 grupe. Tulpinile de cartofi și roșii nu diferă în mod clar, dar tulpinile „cartofului” au fost genetic mai diverse decât cele de „roșii”. Primele au fost găsite în toate cele șapte grupuri, iar cele din urmă, doar în patru, ceea ce indică un genom mai specializat al acestuia (Knapova și Gisi, 2002).
6) Mecanisme de izolare. Dacă populațiile parazitului la două specii de plante gazdă evoluează spre îngustarea specializării la „propria” gazdă, atunci apar diferite mecanisme pre- și postmeiotice care împiedică schimburile genetice interpopulației (Dyakov și Lekomtseva, 1984).
Mai multe studii au investigat efectul sursei tulpinilor parentale asupra eficienței hibridizării. Atunci când tulpinile izolate din diferite specii din genul Solanum au fost încrucișate în Ecuador (Oliva și colab., 2002), s-a constatat că tulpinile cu tipul de împerechere A2 din nopți sălbatice (linia clonală EC-2) au traversat cel mai rău cu tulpini de tomate (linia EC -3), și cel mai eficient încrucișat cu tulpina de cartof (EC-1).
S-a constatat că toți hibrizii sunt nepatogeni. Autorii cred că procentul scăzut de hibridizare și reducerea patogenității la hibrizi se datorează mecanismelor postmeiotice de izolare reproductivă a populațiilor.
În experimentele lui Bagirova și colab. (1998), un număr mare de tulpini de cartofi și roșii au fost încrucișate cu proprietățile raselor T0 și T1. Cele mai fertile încrucișări de tulpini T1xT1 izolate din roșii (36 oospori în câmpul vizual al microscopului, 44% din germinarea oosporilor), cele mai puțin eficiente au fost încrucișări de rase T0xT1 izolate de diferite gazde (un număr redus de oospori în curs de dezvoltare și germinați, o proporție mare de oospori avortați și subdezvoltați) ... Eficiența încrucișărilor între izolatele rasei T0 izolate din cartofi a fost intermediară. Deoarece corpul principal al tulpinilor din rasa T0 afectează cartofii, are o sursă fiabilă de iernare - tuberculi de cartofi, drept urmare importanța oosporilor ca unități infecțioase de iernare pentru populațiile din cartofi este scăzută. „Forma de tomate” adaptată este capabilă să ierneze pe roșie sub formă de oospori (a se vedea mai jos) și, prin urmare, păstrează o productivitate mai mare a procesului sexual. Datorită fertilității sale ridicate, T1 dobândește un potențial independent de infecție primară la tomate. Rezultatele obținute de Knapova și colab. (Knapova și colab., 2002) pot fi interpretate în același mod. Crucile de tulpini izolate din cartofi cu tulpini de roșii au dat cel mai mare număr de oospori - 13,8 pe mm5. mediu (cu o răspândire de 19-6,3) și un procent intermediar de germinare a oosporilor (0 cu o răspândire de 24-7,6). Încrucișările de tulpini izolate din roșii au dat cel mai mic procent de oospori (4 cu o răspândire de 12-10,8) cu cel mai mare procent de germinație (8,6). Încrucișările dintre tulpinile izolate din cartofi au dat un număr intermediar de oospori (0 cu o dispersie mare de date - 30-2,7) și cel mai mic procent de germinare a oosporilor (90). Astfel, tulpinile din cartofi sunt mai puțin fertile decât cele din roșii, dar încrucișările interpopulației nu au dat rezultate mai slabe decât cele intrapopulației. Este posibil ca diferențele cu datele de mai sus de Bagirova și colab. sunt explicate de faptul că cercetătorii ruși au lucrat cu tulpini izolate la începutul anilor '90 ai secolului XX, iar cercetătorii elvețieni - cu tulpini izolate la sfârșitul anilor 'XNUMX.
Baza fertilității scăzute poate fi heteroploidia tulpinilor. Dacă în populațiile mexicane, unde procesul sexual și infecția primară cu descendenți de oospori sunt regulate, majoritatea tulpinilor studiate de P. Infestans sunt diploide, atunci în țările din Vechea Lume se observă polimorfismul plopidiei intrapopulație (di-, tri- și tulpini tetraploidiene, precum și tulpini heterocariote cu nuclei heteroploizi) și tulpini având diferite tipuri de împerechere, adică reciproc fertile, diferă în ceea ce privește ploidia nucleară (Therrien și colab., 1989, 1990; Whittaker și colab., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Diversitatea nucleelor în antheridie și oogonia poate fi motivul fertilității scăzute.
În ceea ce privește schimburile nucleare între hife în timpul anastomozelor, acest lucru este prevenit de incompatibilitatea vegetativă, care împarte populațiile asexuale în multe clone izolate genetic (Poedinok și Dyakov, 1987; Gorbunova și colab., 1989; Anikina și colab., 1997b).
7) Convergența populațiilor. Datele de mai sus indică faptul că hibridizarea între tulpini de „cartof” și „roșie” P. infestans este posibilă. Reinfecția reciprocă a diferitelor gazde este, de asemenea, posibilă, deși cu o agresivitate redusă.
Un studiu al markerilor populației în izolate din câmpurile de cartofi și roșii adiacente în 1993 a arătat că aproximativ un sfert din izolatele izolate din frunzele de roșii au fost transferate dintr-un câmp de cartofi vecin (Dolgova și colab., 1997). Teoretic, s-ar putea presupune că divergența populațiilor pe două gazde ar crește și ar duce la apariția unor forme intraspecifice specializate (f.sp. cartof și f.sp. roșie), mai ales că oosporii pot persista în resturile vegetale (Drenth et. al., 1995; Bagirova, Dyakov, 1998) și semințe de roșii (Rubin și colab., 2001). În consecință, roșiile au în prezent o sursă de regenerare de primăvară independentă de tuberculii de cartofi.
Totuși, totul s-a întâmplat diferit. Iernarea cu oospori a permis parazitului să evite cea mai îngustă etapă din ciclul său de viață - etapa monociclică a vegetației din sol, în timpul căreia scad proprietățile parazite, care se restabilesc treptat în faza policiclică vara.
Tabelul 11. Frecvențele genelor de virulență la soiurile de diferențiere a cartofilor la tulpinile de P. infestans
țară | An | Numărul mediu de gene de virulență la tulpini | Autor | |
din cartofi | din roșie | |||
Franța | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton și colab., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Franța, Elveția | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
Statele Unite ale Americii | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin și colab., 1995 |
SUA, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance și colab., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun și colab., 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusia, Mosk. regiune | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusia, diferite regiuni | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya și alții. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Zoosporangia primară și zoosporii, care germinează oosporii, au un grad ridicat de activitate parazitară, mai ales dacă oosporii s-au format partenogenetic sub influența feromonilor unei tulpini cu tipul opus de împerechere. Prin urmare, materialul infecțios pe răsadurile de tomate cultivate din semințe infectate cu oospori este extrem de patogen atât pentru roșii, cât și pentru cartofi.
Aceste schimbări au condus la o altă restructurare a populației, exprimată în următoarele schimbări importante din punct de vedere epidemiologic:
- Răsadurile infectate de roșii au devenit o sursă importantă de infecție primară a cartofilor (Filippov, Ivanyuk, mesaje personale).
- Epifitotiile pe cartofi au început să fie observate încă din iunie, cu aproximativ o lună mai devreme decât de obicei.
- În plantațiile de cartofi, a crescut procentul rasei T1, care a fost găsit anterior acolo într-o cantitate nesemnificativă (Ulanova și colab., 2003).
- Tulpinile izolate din frunzele de roșii nu mai difereau de tulpinile de cartofi în virulență pe diferențiatorii genelor de virulență și au început să depășească tulpinile de „cartof” în agresivitate nu numai pe roșii, ci și pe cartofi (Lavrova și colab., 2003; Ulanova și colab. , 2003).
Astfel, în loc de divergență, a existat o convergență a populațiilor, apariția unei singure populații pe două plante gazdă cu virulență ridicată și agresivitate la ambele specii.
Concluzie
Deci, în ciuda a peste 150 de ani de studiu intensiv al P. infestans, în biologie, inclusiv biologia populației acestui agent cauzator al celor mai importante boli ale plantelor solanacee cultivate, multe rămân necunoscute. Nu este clar cum trecerea etapelor individuale ale ciclului de viață afectează structura populațiilor, care sunt mecanismele genetice ale variabilității canalizate a agresivității și virulenței, care este raportul dintre sistemele de reproducere și clone de reproducere în populațiile naturale, modul în care se moștenește incompatibilitatea vegetativă, care este rolul cartofilor și roșiilor în infecția primară a acestor culturi și în care este efectul acestora asupra structurii populației parazitului. Până în prezent, probleme practice atât de importante precum mecanismele genetice pentru schimbarea agresivității parazitului sau eroziunea rezistenței nespecifice a cartofului nu au fost rezolvate. Odată cu aprofundarea și extinderea cercetării asupra bolii târzii a cartofului, parazitul pune noi provocări cercetătorilor. Cu toate acestea, îmbunătățirea capacităților experimentale, apariția unor noi abordări metodologice de manipulare cu gene și proteine ne permit să sperăm la o soluție de succes a întrebărilor puse.
Articolul a fost publicat în revista „Protecția cartofului” (nr. 3, 2017)