D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Ciuperca fitopatogenă Colletotrichum coccodes provoacă boli periculoase la cartofi și roșii cunoscute sub numele de antracnoză și pata neagră a tuberculilor. Prin caracteristicile morfologice, acestea sunt adesea dificil de distins de bolile cauzate de alte microorganisme; la fructele de roșii verzi, boala poate fi asimptomatică, manifestându-se doar la fructele roșii coapte. Pentru un diagnostic rapid și precis al agentului patogen, este oferit un sistem de testare PCR în timp real. Pentru a dezvolta un sistem de testare, s-a determinat secvența nucleotidică a genei glicerol trifosfat dehidrogenazei a 45 de tulpini de cocod izolate din tuberculii de cartof din diferite regiuni din Rusia.
Pe baza rezultatelor obținute și a analizei secvențelor similare ale altor specii disponibile în baza de date GenBank, au fost proiectate primeri specifici speciei și sondă pentru C. coccodes. Pentru a verifica specificitatea sistemului de test creat, PCR a fost efectuată cu ADN izolat din culturi pure de 15 specii diferite de ciuperci parazitare și saprotrofe asociate cu plantele de roșii și cartofi (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Prezența ADN-ului Colletotrichum coccodes a fost determinată la un ciclu de prag de 20-27, în timp ce alte specii au fost detectate după 40 de cicluri sau nu au fost detectate. Sistemul de testare face posibilă detectarea în mod fiabil a concentrațiilor de ADN de cocoduri care depășesc 0.01 ng / mm3 în amestecul de PCR analizat. Folosind sistemul de testare dezvoltat, a fost investigată prezența C. coccodes în frunzele de roșii cu simptome ale bolilor fungice și în tuberculii de cartof fără simptome externe ale bolii. Frunzele cu simptome de infecție fungică au fost colectate din două câmpuri diferite din teritoriul Krasnodar, tuberculi - din câmpurile din regiunile Kostroma, Moscova, Kaluga, Nijni Novgorod. O frunză de roșie care conține ADN-ul C. coccodes a fost găsită în teritoriul Krasnodar; prezența semnificativă a ADN-ului acestui agent patogen a fost detectată în 5 probe de tuberculi cultivate în regiunile Kostroma, Moscova, Kaluga.
Introducere
Ciupercile din genul Colletotrichum sunt fitopatogene periculoase care afectează cerealele, legumele, ierburile, fructele perene și plantele de fructe de pădure. Una dintre speciile omniprezente din acest gen, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, este agentul cauzal al antracnozei și al petei negre de cartofi și roșii și provoacă boli ale mai multor alte plante din familia Solanaceae, incl. buruieni (Dillard, 1992). C. coccodes afectează toate părțile subterane ale plantei, bazele tulpinilor, frunzele și fructele (Andrivon și colab., 1998; Johnson, 1994). Pe coaja tuberculilor infectați se observă dezvoltarea unor pete cenușii cu margini pronunțate în mod distinct, pe care sunt clar vizibile puncte negre de sporulare și microsclerotie. În timpul depozitării, se pot forma ulcere cu conținut înmuiat în pulpa tuberculilor, adică boala intră în faza de antracnoză, care, însă, este extrem de rară.
În același timp, simptomele antracnozei (ulcere ale pielii cu mici puncte negre) sunt tipice fructelor de roșii. Pe frunze, simptomele C. coccodes apar ca pete maro închis, de obicei mărginite de țesut galben (Johnson, 1994).
Dezvoltarea petei negre pe tuberculi le strică aspectul, care se manifestă mai ales atunci când se vând cartofi spălați cu piele roșie. Exfolierea cojii duce la excesul de evaporare și la pierderile crescute de depozitare (Hunger, McIntyre, 1979). Deteriorarea altor organe vegetale duce la pierderi de randament, care au fost observate atât în teren deschis, cât și închis (Johnson, 1994; Tsror și colab., 1999). Bolile cauzate de C. coccodes sunt frecvente în aproape toate regiunile producătoare de cartofi din lume, inclusiv în Rusia (Leesa, Hilton, 2003; Belov și colab., 2018). Controlul acestor boli este dificil din cauza eficienței insuficiente a fungicidelor existente împotriva C. coccodes și a lipsei de soiuri rezistente (Read, Hide, 1995).
C. coccodes inoculum poate persista în tuberculi de semințe (Read, Hide, 1988; Johnson și colab., 1997), semințe de roșii (Ben-Daniel și colab., 2010), pot supraviețui mult timp în sol, pe resturile vegetale (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) și în buruieni (Raid, Pennypacker, 1987). Un număr de autori (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson și colab., 1997; Dillard, Cobb, 1993) au arătat că dezvoltarea bolii la cartofi și roșii depinde în mare măsură de prezența inoculului în semințe și sol. Prin urmare, pentru a reduce la minimum pierderile cauzate de boală, este necesar să se diagnosticheze (inclusiv cantitativ) propagulele ciupercii în materialul semințelor, în sol, în tuberculii de cartofi și semințele de roșii așezate pentru depozitare. Diagnosticul morfologic în sol și material vegetal poate fi efectuat numai prin prezența microsclerotiei, care, totuși, se găsesc și în alte tipuri de ciuperci.
Simptomele de pe tuberculi sunt foarte asemănătoare cu crusta de argint cauzată de ciuperca Helminthosporium solani. Izolarea coccodelor Colletotrichum și Helminthosporium solani într-o cultură pură este destul de dificilă și durează mult, datorită creșterii lente pe un mediu nutritiv. Pentru a identifica rapid coccodele Colletotrichum, este necesar să se utilizeze metode instrumentale de diagnostic. Cea mai convenabilă metodă este reacția în lanț a polimerazei (PCR) și modificarea acesteia - PCR în timp real. În prezent, un sistem de testare dezvoltat de cercetători britanici (Cullen și colab., 2002) pentru regiunea ITS1 a ADNr este utilizat în Europa și Statele Unite. Utilizarea acestuia a arătat rezultate bune în analiza izolatelor rusești (Belov et al, 2018). Cu toate acestea, C. coccodes este foarte variabil și detectarea acestuia dintr-o singură secvență de ADN poate duce la rezultate fals negative. Pentru un diagnostic mai fiabil, este necesar să analizăm mai multe secvențe de ADN specifice speciilor, în legătură cu care am dezvoltat un sistem de testare original care ne permite să identificăm C. coccodes prin secvența genei gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază.
materiale si metode
Pentru a evalua eficacitatea și specificitatea sistemelor de testare create, am folosit culturi pure de 15 specii de ciuperci izolate de autori din probe bolnave de frunze și fructe de roșii, tuberculi de cartofi (Tabelul 1). Pentru izolare, am luat organe de plante cu simptome de infecție fungică, nu mai mult de un organ pe tufă.
O felie de tubercul cu coajă, o felie de fruct de roșie și o frunză afectată au fost plasate sub un microscop binocular, după care miceliul, sporii sau o bucată de țesut au fost transferați către un mediu de agar (agar de must) într-o cutie Petri cu un ac de disecție ascuțit. Izolatele au fost depozitate pe oblică înclinată în eprubete la 4 ° C.
Probele de frunze de roșii cu simptome de boli fungice destinate analizei au fost plasate imediat după recoltare (în câmp) în alcool etilic 70% în care au fost depozitate până la izolarea ADN-ului. Tuberculii de cartof au fost livrați la laborator, decojiti (bucată de 2 × 1 cm) din ei și congelați la –20 ° С. Depozitat congelat până la izolarea ADN-ului.
Culturile pure de ciuperci pentru izolarea ADN-ului au fost cultivate în mediu lichid de mazăre. Miceliul ciupercii a fost îndepărtat din mediul lichid, uscat pe hârtie de filtru, congelat în azot lichid, omogenizat, incubat în tampon CTAB, purificat cu cloroform, precipitat cu un amestec de izopropanol și acetat de potasiu 0.5 M și spălat de două ori cu 2% alcool. ADN-ul rezultat a fost dizolvat în apă deionizată și stocat la –70 ° С (Kutuzova și colab., 20). Concentrația ADN a fost măsurată folosind un kit de cuantificare ADN HS pentru ADN dublu catenar pe Qubit 2017 (Qiagen, Germania). Probele alcoolizate și congelate au fost triturate în azot lichid, apoi extracția ADN a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus (pentru miceliul culturilor fungice pure).
Tabelul 1. Originea tulpinilor fungice utilizate
Numele ciupercii | Plantă, organ | Locul selecției |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | tubercul de cartofi | Regiunea Kostroma, tuberculi de cartofi din prima generație de câmp, soiul Red Scarlett |
Colletotrichum cocodes 4 | frunza de cartof | Reprezentant. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | tubercul de cartofi | Regiunea Magadan, pos. Cort, tubercul de cartofi |
Cladosporium fulvum | frunza de tomate | Regiunea Moscovei, roșii cu fructe mari |
Alternaria tomatophila | fructe de roșii | predat de către personalul laboratorului de micologie și fitopatologie al Institutului de cercetare din Rusia pentru protecția plantelor |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | fructe de roșii | Teritoriul Krasnodar, districtul Krymsky, clasa Cream |
Fusarium oxysporum | rădăcină de grâu | Regiunea Moscovei |
PCR a fost efectuat pe un amplificator DTprime (DNA-Technology). Pentru PCR, s-au utilizat primerii originali și o sondă pentru regiunea specifică speciei genei glicerol trifosfat dehidrogenază: primerul Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, primerul Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Primerii amplifică o regiune de 213 bp.
Reacția a luat 50 ng de ADN total (când se analizează frunze și tuberculi) și 10 ng (când se analizează ADN de culturi fungice pure). Amestecul de reacție (35 μl) a fost separat de un strat de parafină în două părți: cel inferior (20 μl) conținea 2 μl de 10 × tampon de reacție (750 mM Tris-HCI, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM din fiecare trifosfat deoxinucleotidic, 7 pmol din fiecare primer și 4 pmol dintr-o sondă fluorescentă hidrolizabilă; cea superioară conținea 1 μl de 10 × tampon PCR și 1 U de polimerază Taq.
Separarea amestecului cu parafină permite păstrarea tuburilor pentru o lungă perioadă de timp la o temperatură de 5 ° C și pentru a oferi un pornire la cald pentru PCR după încălzirea lor timp de 10 minute la o temperatură peste 80 ° C. PCR a fost efectuată conform următorului program: 94.0 ° C - 90 s (1 ciclu); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cicluri); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cicluri); 10.0 ° C - depozitare.
rezultate si discutii
Secvențele genei glicerol trifosfat dehidrogenazei au fost determinate în 45 de tulpini izolate din frunze, tulpini, tuberculi de cartof și fructe de roșii (Kutuzova, 2018) în diferite regiuni ale Rusiei. Secvențele studiate ale tuturor tulpinilor au fost împărțite în 2 grupuri care diferă în două nucleotide. Secvențele nucleotidice ale reprezentanților ambelor grupuri sub numerele KY496634 și KY496635 sunt depuse în GenBank.
Primerii coc70gdf, coc280gdr și sonda cocgdz proiectate pe baza lor au fost verificate utilizând programul BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) pe toate secvențele genei glicerol trifosfat dehidrogenazei a speciilor din genul Colletotrichum și a altor organisme disponibile în baza de date GenBank.
Nu s-au găsit regiuni de ADN ale altor organisme extrem de omoloage cu primerii și sonda.
Sensibilitatea sistemului de testare a fost verificată folosind probe cu concentrații diferite de ADN de C. coccodes, ADN-ul unei frunze de cartof infectat cu antracnoză (colectat în 2017 în Mari El, soiul Red Scarlett) și coaja tuberculilor afectați de pata neagră (colectată în regiunea Kostroma, varietate Red Scarlett, tabelul 2). Pentru a confirma prezența ADN-ului în tuberculi și frunze de cartof, tulpinile de C. coccodes au fost izolate din ele în culturi pure.
Rezultatele analizei de sensibilitate a sistemului de testare arată că acesta poate fi utilizat pentru a diagnostica cu succes prezența ADN-ului C. coccodes într-o probă atunci când conținutul său total în amestecul PCR este mai mare de 0.05 ng. Acest lucru este suficient pentru detectare, deoarece o sclerotie conține, în medie, 0.131 ng, iar un spor conține aproximativ 0.04 ng de ADN (Cullen și colab., 2002). Sistemul de testare dezvoltat de grupul englez (Cullen și colab., 2002) a arătat o sensibilitate similară (ciclul de prag 34 la 0.05 ng ADN și 37 la 0.005 ng).
Analiza eșantioanelor naturale care conțin C. coccodes în toate cazurile a făcut posibilă dezvăluirea prezenței sale în probă (Tabelul 2). Metoda propusă pentru izolarea ADN-ului a fost aplicabilă și analizei probelor de plante naturale.
Tabelul 2. Determinarea sensibilității sistemului de testare propus pentru identificarea coccodelor Colletotrichum pentru PCR în timp real
Образец | Cantitatea de ADN din probă *, ng | Ciclul prag | C. detectarea cocodelor |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Coaja tuberculului 1 | 50 | 32 | + |
Coaja tuberculului 2 | 50 | 30 | + |
Coaja tuberculului 3 | 50 | 31.5 | + |
Frunza de cartof | 50 | 29.5 | + |
Notă. * Într-un amestec de produse PCR.
Specificitatea sistemului de testare a fost verificată pe probe de ADN extrase din 15 specii de ciuperci. Toate tulpinile de ciuperci au fost izolate de autori din fructe afectate și sănătoase și frunze de roșii, tuberculi de cartofi; o tulpină a fost izolată din rădăcina de grâu (Tabelul 1). Printre cele izolate de suprafața fructului, există specii care nu sunt patogene pentru tomate (de exemplu, Phellinus ferrugineovelutinus).
Studiile au arătat că ADN-ul C. coccodes a fost detectat la un ciclu prag de 20-27, în timp ce alte specii fungice nu au fost detectate sau au dat un semnal după ciclul 40, care poate fi atribuit unui efect de zgomot nespecific (Tabelul 3).
Tabelul 3. Verificarea sistemului de testare pentru diferite tipuri de ciuperci
Numele ciupercii | Ciclul prag |
Colletotrichum cocodes 1 | 20.9 |
C. cocoduri 2 | 22.6 |
C. cocoduri 3 | 23 |
C. cocoduri 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Notă. * Cantitatea de ADN din toate probele a fost de 10 ng.
Sistemul de testare dezvoltat a fost utilizat pentru a identifica C. coccodes în probele de frunze de roșii cu simptome de agenți patogeni necrotrofici și tuberculi de semințe de cartof fără simptome vizibile. Pentru studiu, am luat tuberculi de semințe din diferite soiuri cultivate în regiunile Kostroma, Moscova, Kaluga, Nijni Novgorod. Prezența ADN-ului C. coccodes a fost considerată semnificativă în eșantioane, în analiza cărora ciclul prag nu a depășit 35. Această valoare prag a fost selectată pe baza determinării fiabile a 0.05 ng de ADN C. coccodes (ciclul prag 33.5, tabelul 2) și faptul la cicluri de prag peste 40, a fost diagnosticat ADN nespecific al altor specii fungice. Cu această abordare, prezența semnificativă a ADN-ului C. coccodes a fost detectată în 5 probe de tuberculi cultivate în regiunile Kostroma, Moscova, Kaluga și într-o frunză de roșie din regiunea Yeisk din regiunea Krasnodar (Tabelele 4, 5).
Tabelul 4. Detectarea coccodelor Colletotrichum pe tuberculi de cartofi *
Numărul eșantionului | Soi de cartofi | Locul de creștere | C. detectarea cocodelor | Ciclul prag |
---|---|---|---|---|
1 | Red Scarlet | Regiunea Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Regiunea Moscovei | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky devreme | Regiunea Moscovei | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Regiunea Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantezie | Regiunea Kaluga | - | |
15 | gală | Regiunea Nizhny Novgorod | - | |
16 | - |
Notă. * Cantitatea de ADN din toate probele a fost de 50 ng.
Tabelul 5. Detectarea coccodelor Colletotrichum pe frunzele de roșii *
Numărul eșantionului | Locul de creștere | C. detectarea cocodelor | Ciclul prag |
---|---|---|---|
1 | Teritoriul Krasnodar, districtul Crimeea | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Teritoriul Krasnodar, districtul Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Cantitatea de ADN din toate probele a fost de 50 ng.
Sistemul de testare creat de noi nu este inferior celui dezvoltat de cercetătorii britanici (Cullen și colab., 2002) în sensibilitate și specificitate și este potrivit pentru analiza probelor de plante. Aplicarea sa pentru analiza tuberculilor de semințe a făcut posibilă identificarea ADN-ului C. coccodes în tuberculi fără semne externe de deteriorare și analiza cu succes a infecției frunzelor.
Până în prezent, în Rusia nu a fost efectuată nicio analiză a tuberculilor de cartof pentru infestarea cu C. coccodes. Primul nostru studiu a arătat că din 16 tuberculi de semințe testați, crescuți în diferite regiuni ale Federației Ruse, 5 conțin C. coccodes. Acest lucru arată că pata neagră a tuberculilor de cartof este o boală comună a cartofului în Rusia, iar rolul său în reducerea volumului și calității culturii de cartofi este subestimat.
Analiza frunzelor de roșii a relevat o prezență semnificativă a ADN-ului C. coccodes într-o frunză din districtul Yeisk din teritoriul Krasnodar. Anterior, la examinarea câmpurilor de tomate din sudul Rusiei folosind sistemul de testare britanic (Cullen și colab., 2002), s-au găsit frunze care conțin C. coccodes, iar în unele câmpuri s-a găsit o proporție mare de frunze infectate cu C. coccodes (Belov și colab., 2018). În teritoriile Krasnodar și Primorsky, regiunea Moscovei, am găsit fructe de roșii, din care am reușit să izolăm culturi pure de C. coccodes. Este posibil ca C. coccodes să fie mult mai răspândit pe tomate în Rusia decât se crede acum, iar nocivitatea sa este, de asemenea, subestimată.
Astfel, până în prezent s-au acumulat suficiente informații cu privire la distribuția pe scară largă a C. coccodes pe cartofi și roșii.
Pentru a înțelege mai bine rolul acestei ciuperci în dezvoltarea bolilor cartofului și a roșiilor, este necesar să se monitorizeze prevalența acesteia în Rusia, să se studieze rolul infecțiilor solului și semințelor și rolul petei negre în pierderile din timpul depozitării. Utilizarea diagnosticului PCR poate facilita în mod semnificativ acest lucru, iar utilizarea simultană a ambelor sisteme de testare va crește semnificativ acuratețea analizei.
Această lucrare a fost susținută de subvenția Fundației pentru Științe din Rusia nr. 18-76-00009.
Articolul a fost publicat în revista Mycology and Phytopathology (volumul 54, nr. 1, 2020).