MÂNCA. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Recent s-a demonstrat că ciuperca ascomicetă Ilyonectria crassa este capabilă să infecteze tuberculii cartofului. Această lucrare este prima care analizează caracteristicile biologice și rezistența la unele fungicide ale tulpinii I. crassa izolate din cartofi. Secvențele regiunilor specifice speciei din tulpina „cartof” au coincis cu cele obținute anterior pentru ciuperci izolate din rădăcinile narcisei, ginsengului, aspenului și fagului, bulbilor de crin și frunzelor de lalea. Aparent, multe plante sălbatice și de grădină pot fi rezerve de I. crassa. Tulpina investigată a infectat roșii și felii de cartof, dar nu a infectat întregul fruct de roșie și tuberculul intact de cartofi. Aceasta arată că I. crassa este un parazit al plăgii. Evaluarea rezistenței la fludioxonil, difenoconazol și azoxistrobin pe un mediu nutritiv a arătat o eficacitate ridicată a acestor medicamente.
Indicatorul EC50 (concentrația fungicidului, care încetinește de 2 ori rata de creștere radială a coloniei în raport cu controlul non-fungicid) a fost egal cu 0.4; 7.4 și respectiv 4 mg / l. Posibilitatea dezvoltării bolii cauzate de I. crassa trebuie luată în considerare la evaluarea fitopatologică a tuberculilor de cartof și la dezvoltarea măsurilor de protecție a plantelor.
Dezvoltarea microorganismelor fitopatogene duce la pierderi mari în toate etapele de creștere și depozitare a cartofilor. La planificarea măsurilor de protecție, de regulă, se iau în considerare agenți patogeni cunoscuți, cum ar fi speciile din genurile Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora etc. Cu toate acestea, în ultimii ani, au apărut din ce în ce mai multe rapoarte despre apariția de noi microorganisme fitopatogene pe cartofi. Biologia lor este slab studiată, eficacitatea fungicidelor utilizate pe cartofi în raport cu aceștia este necunoscută, metodele de diagnostic nu au fost dezvoltate. Cu o dezvoltare masivă, acestea sunt capabile să provoace daune semnificative culturii de cartofi. Unul dintre aceste microorganisme este ciuperca ascomicetă Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, descoperită pentru prima dată de autori pe tuberculii de cartof (Chudinova și colab., 2019).
Această lucrare prezintă rezultatele analizei tulpinei I. crassa izolată din tuberculii de cartof. Au fost studiate morfologia coloniilor și structurilor miceliale ale I. crassa, secvențele nucleotidice ale regiunilor ADN specifice speciei, virulența la cartofi și roșii și rezistența la unele fungicide populare.
materiale si metode
Am folosit tulpina I. crassa 18KSuPT2 izolată în 2018 din tuberculul de cartof infectat cultivat în regiunea Kostroma. Tuberculul a fost afectat de un tip de putregai uscat, cu o cavitate acoperită cu miceliu maro deschis. Folosind un ac steril de disecție, miceliul fungic a fost transferat într-o cutie Petri cu un mediu de agar (must de bere 10%, agar 1.5%, penicilină 1000 U / ml). Plăcile au fost incubate în întuneric la 24 ° C.
Un microscop cu lumină Leica DM2500 cu o cameră digitală ICC50 HD și un microscop binocular Leica M80 cu o cameră digitală IC80HD (Leica Microsystems, Germania) au fost folosite pentru a fotografia, evalua dimensiunea și morfologia sporilor și a organelor de spori.
Pentru a izola ADN-ul, miceliul fungic a fost crescut în mediu lichid de mazăre, apoi congelat în azot lichid, omogenizat, incubat în tampon CTAB, purificat cu cloroform și spălat de două ori cu 2% alcool.
Metoda de extracție a ADN-ului este descrisă în detaliu în articolul lui Kutuzova și colab. (2017).
Pentru a determina speciile prin metode moleculare și pentru a compara cu alte tulpini de I. crassa cunoscute, PCR a fost efectuată cu primeri care permiteau amplificarea regiunilor ADN specifice speciei: ITS1-5,8S-ITS2 (primeri ITS5 / ITS4, White și colab., 1990), regiuni genetice b -tubulină (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) și factorul de alungire a traducerii 1α (tef1α) (primeri EF1-728F / EF1-986R, Carbone și Kohn, 1999). Ampliconii cu lungimea dorită au fost extrasați din gel folosind kitul Evrogen CleanUp. Regiunile amplificate au fost secvențiate folosind BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, SUA) pe un Applied Biosystems 3730 xl sequencer automat (Applied Biosystems, CA, SUA). Secvențele de nucleotide obținute au fost utilizate pentru a căuta o potrivire în baza de date GenBank a Centrului Național pentru Informații despre Biotehnologie (NCBI) din SUA. Analiza filogenetică a fost efectuată folosind programul MEGA 6 (Tamura și colab., 2013).
Determinarea virulenței a fost efectuată pe fructe verzi întregi de roșii cu fructe mari (soiul Dubrava) și tuberculi de cartofi (soiul Gala). În plus, pentru a simula deteriorarea fructelor și tuberculilor deteriorați, am folosit felii din aceleași fructe și tuberculi. Felii de tuberculi au fost așezate în camere umede, care erau cutii Petri cu hârtie de filtru umedă în partea de jos. Pe hârtie a fost așezată o lamă, pe care, la rândul ei, au fost așezate felii de tuberculi sau fructe. Tuberculii și fructele întregi au fost, de asemenea, așezate în recipiente cu hârtie de filtru umedă în partea de jos. În centrul feliei (sau pe suprafața intactă a tuberculului sau a fructului), o bucată de agar (5 × 5 mm) cu hife fungice a fost plasată după 5 zile de creștere pe agar de must.
Evaluarea rezistenței tulpinilor fungice la fungicide a fost efectuată în condiții de laborator pe mediu nutritiv de agar. Am studiat susceptibilitatea la medicamente fungicide Maxim, KS (ingredient activ fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxistrobină 250 g / l), Scor, EC (difenoconazol 250 g / l) (Catalog de stat ..., 2020). Evaluarea a fost efectuată în cutii Petri pe un mediu de must-agar cu adăugarea medicamentelor studiate la o concentrație a substanței active de 0.1; unu; 1 ppm (mg / L) (pentru fludioxonil și difenoconazol), 10; zece; 1 ppm (pentru azoxistrobină) și în mediu fără fungicid (martor). Fungicidul a fost adăugat la mediul topit și răcit la 10 ° C mediu, după care mediul a fost turnat în cutii Petri. Un bloc de agar cu miceliu fungic a fost plasat în centrul unei cutii Petri și cultivat la o temperatură de 100 ° C în întuneric. După 60 zile de incubație, diametrele coloniilor au fost măsurate în două direcții reciproc perpendiculare; rezultatele măsurătorilor pentru fiecare colonie au fost mediate. Experimentele au fost efectuate în trei exemplare. Pe baza rezultatelor analizelor, a fost calculat EC24, egal cu concentrația fungicidului, care a redus la jumătate rata de creștere radială a coloniei în raport cu controlul fungicid.
rezultate si discutii
Pe vasele Petri cu agar de must, ciuperca a format colonii cu miceliu floculent alb. Mediul de sub miceliu a devenit roșu-maroniu. Când mediul se usucă, ciuperca a format spori de două tipuri pe conidiofori unici și agregați în mici sporodochii. Macroconidia este alungită, cilindrică, cu una până la trei septuri, lungime medie 27.2 µm, cu o gamă de valori cuprinse între 23.2 și 32.2 µm, lățime - până la 4.9 µm (Fig. 1). Lungimea medie a microconidiei este de 14.3 µm cu o gamă de valori de la 10.3 la 18.1 µm, lățimea este de până la 4.0 µm. Toate caracterele macro și micromorfologice se încadrează în gama de variații a speciei Ilyonectria crassa (Cabral și colab., 2012).
Secvențele regiunilor ADN specifice speciilor (ITS, b-tubulină, TEF 1α) au coincis complet cu secvențele tulpinilor I. crassa pe care le-am studiat anterior (Chudinova și colab., 2019, Tabelul 1). Pentru a studia prevalența I. crassa în alte regiuni și pentru a analiza spectrul culturilor afectate, au fost analizate secvențe de ADN analog în baza de date GenBank (Tabelul 1). Suprapunerea a fost de 86 la 100%. Secvențele tuturor celor trei regiuni ADN ale tulpinei I. crassa de „cartof” au fost identice cu secvențele tulpinilor izolate din bulbii de crin și rădăcinile de narcis din Olanda și din rădăcina de ginseng din Canada. Nu am reușit să găsim alte tulpini de I. crassa cu trei secvențe similare analizate în baze de date deschise. Cu toate acestea, analiza secvențelor ITS și b-tubulin depuse a arătat prezența I. crassa pe frunzele de lalea din Marea Britanie. Ciupercile cu o secvență ITS similară au fost identificate în analiza micobiotei de rădăcini de aspen în Canada și rădăcini de fag în Italia, tuberculi de cartofi în Arabia Saudită (Tabelul 1). Rezultatele acestui studiu arată că I. crassa are o distribuție globală și este capabilă să infecteze diferite specii de plante.
La determinarea patogenității pe felii de roșii și cartofi în ziua a 5-a, diametrul leziunii a ajuns la 1.5 cm. Tulpina investigată nu a infectat întregul fruct de roșie și tuberculul de cartof intact. Cu toate acestea, sepalele au fost afectate pe roșie. Pentru a exclude posibilitatea contaminării, un izolat fungic din miceliu dezvoltat pe o felie de tubercul de cartof a fost izolat într-o cultură pură. Era complet identic cu tulpina părintească. Aparent, I. crassa este un parazit al plăgii.
Tratamentul pre-plantare a tuberculilor de semințe cu fungicide reduce dezvoltarea bolilor pe plante în timpul sezonului de creștere. Pentru selectarea fungicidelor eficiente, este important să se evalueze care dintre ele sunt eficiente împotriva I. сrassa. Lucrarea a studiat substanțele active răspândite ale fungicidelor - fludioxonil, azoxistrobină, difenoconazol. Fludioxonil este inclus în mai multe amestecuri utilizate pentru prepararea semințelor și tuberculilor de semințe înainte de plantare. Fludioxonil (Maxim) este, de asemenea, utilizat pentru tratarea tuberculilor de semințe înainte de depozitare. Difenoconazolul și azoxistrobina sunt, de asemenea, incluse într-o serie de preparate utilizate pentru prelucrarea materialului semințelor, precum și în preparatele destinate procesării plantelor vegetative (catalogul de stat ..., 2020).
Rata de creștere a I. crassa a fost studiată pe medii (Fig. 2) cu diferite concentrații de substanțe active: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxistrobină (EC50 = 4 ppm) și difenoconazol (EC50 = 7.4 ppm) (Tabelul 2). Aceste preparate pot fi considerate extrem de eficiente împotriva I. crassa, deoarece EC50 este semnificativ mai mică decât concentrația recomandată a preparatului în fluidul de lucru utilizat pentru tratarea tuberculilor. Conform Catalogului de Stat ... (2020), concentrația de fludioxonil în lichid pentru tratarea tuberculilor de cartof este de la 500 la 1000 ppm, azoxistrobină (în lichidul pentru tratarea fundului brazdei) - 3750-9375 ppm, difenoconazol (în lichidul pentru tratarea plantelor vegetative) - 187.5– 625 ppm.
Tabelul 1. Similitudinea secvenței secvențelor specifice speciei de tulpină 18KSuPT2 și tulpini de Ilyonectria crassa disponibile în baza de date Genbank
Încordare | Planta gazdă, locul excreției | Numere de secvență depuse în GenBank, procent de asemănări | Legătură | ||
ESTE | β-tubulină | TEF 1α | |||
17KSPT1 și 18KSuPT2 | Tubercul de cartofi, regiunea Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova și colab., 2019, această lucrare |
CBS 158/31 | Rădăcini de narcis, Olanda | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral și colab., 2012 |
CBS 139/30 | Bulbul de crin, Olanda | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Rădăcină de ginseng, Canada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Frunza de lalea, Marea Britanie | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Rădăcini Aspen, Canada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield și colab., 2020 |
ER1937 | Fag, Italia | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Depunere directă |
KAUF19 | Tubercul de cartofi, Arabia Saudită | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = nedepozitat
Tabelul 2. Rezistența Ilyonectria crassa la fungicide
(substanta activa) | EC50, ppm | ||||
3 zi | 5 zi | 7 zi | |||
Controlați | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxistrobină) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenoconazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
În munca noastră, tulpinile I. crassa au fost izolate din tuberculii de cartofi din regiunile Kostroma și Moscova (Chudinova și colab., 2019). O proporție ridicată de tulpini fungice cu secvențe ITS identice cu I. crassa a fost dezvăluită la analiza micobiotei tuberculilor de cartof din Arabia Saudită (Gashgari și Gherbawy, 2013). Aparent, I. crassa nu este la fel de rară pe cartofi pe cât ar părea. Experimentele noastre au arătat că ciuperca ar putea infecta roșiile deteriorate. Din literatură se știe că I. crassa este capabil să se dezvolte în sol în mod saprotrofic (Moll și colab., 2016), precum și să afecteze o varietate de plante, chiar și cele îndepărtate din punct de vedere taxonomic, cum ar fi narcise, crini, ginseng, aspen și fag (Tabelul 1). unu). Aparent, multe plante sălbatice și de grădină pot fi rezerve de I. crassa. Cele de mai sus arată că atunci când se dezvoltă măsuri de protecție, este necesar să se ia în considerare posibilitatea de a afecta tuberculii de cartofi cu această ciupercă. Preparatele pe scară largă pentru tratamentul tuberculilor de cartofi care conțin fludioxonil, azoxistrobină și difenoconazol au demonstrat o eficacitate fungicidă ridicată împotriva I. crassa.
Această lucrare a fost susținută de Fundația Rusă pentru Cercetare de Bază (Grant nr. 20-016-00139).
Articolul a fost publicat în revista „Buletin de protecție a plantelor”, 2020, 103 (3)